猪流行性腹泻诊断方法
杨巍 东北农业大学
猪流行性腹泻（PED）与猪传染性胃肠炎（TGE）的临床症状极其相似，所以仅根据兽医临床症状来诊断 PED 是非常困难的。最初在实验室中，主要依靠病毒分离、病毒中和试验和免疫荧光试验等方法来检测 PEDV，虽然这些方法都能对 PED 作出准确的诊断，但是操作复杂而且耗时长。现在随着分子生物学的发展，一些新的实验技术逐步被应用到 PED 的诊断当中。
1 PCR 诊断方法
Ishikawa 等根据 S 基因序列设计了一对可扩增目的片段长度为 854 bp 的引物，成功地建立了诊断 PEDV 的 RT-PCR 法。此方法 8 小时内即可检测出细胞毒和粪便毒，灵敏度可达 100 TCID50/ml。Kubota等根据 N 基因序列设计了一对可扩增目的片段长度为540 bp 的引物，成功地建立了诊断 PEDV 的 RT-PCR 法，该方法可进行细胞毒和粪便毒的检测。在韩国已建立了 TGEV 和 PEDV 的二联 RT-PCR 诊断方法，可同时检测出 10 TCID50/ml 的 TGEV 和 PEDV。Kim O 等对免疫组化、原位杂交、RT-PCR 这三种方法的检测效果进行了比较，认为 RT-PCR 法检测结果的重复性最好。但当被检样品被福尔马林固定时，免疫组化和原位杂交这两种方法效果更好。此外，Kim O 等还建立了鉴别 TGEV 和 PEDV 的多重巢式 RT-PCR 法。
Song 等建立了鉴别诊断 PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（porcine rotavirus, PoRV）的多重反转录 PCR（Multi-RT-PCR）为鉴别这三种病毒性腹泻病原的混合感染提供了技术支持，同时又建立了检测 PEDV 的实时荧光定量 PCR，对仔猪体内PEDV 的病毒载量进行了定量；国内的乔宪凤等以 PEDV 的膜蛋白（M）的 RNA 为模板，根据 Durate 等人发表的基因序列，设计了三条位于 PEDV 膜蛋白（M）基因上的引物，来进行 RT-PCR 反应，确立了 RT-PCR 最适反应条件。 尽管 RT-PCR 法敏感性和特异性都很好，但由于需要特殊的仪器设备，目前只适合于实验室诊断，不适合于临床诊断。
2 ELISA
ELISA 法最大的优点是可从粪便中直接检查 PEDV 抗原，目前应用也较为广泛。朱维正等应用双抗体 ELISA 法从腹泻病猪粪便中直接检测病毒抗原，其与电镜检查的阳性符合率为 97.37%，阴性符合率为 100%。陈茹等用分离纯化的 PEDV 抗原，建立斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）检测 PEDV 抗体。采用此方法对 834 份分别来自加拿大、台湾省进口的种猪和海南省、广东省种猪群的血清样进行了检测，检测的抗体阳性率达 21%。
与琼扩试验相比 Dot-ELISA 更敏感，重复性更好。 Rodak L 等利用 PEDV M 蛋白的单克隆抗体建立了敏感性强、特异性高的竞争阻断 ELISA 诊断方法，适于 PEDV 流行病学调查；Oh 等建立了间接 ELISA 诊断方法，与病毒血清中和试验对比证明，该 ELISA 方法具有较高的敏感性和特异性，能用于 PEDV的检测；Hou 等利用 PEDV 重组 N 蛋白抗原建立了检测 PEDV 血清的 ELISA 方法，为 PEDV 血清学检测提供手段。
3 微量血清中和试验
林志雄等建立了 PEDV 微量中和试验。以 PK15（猪肾细胞）作为指示细胞，采用适应于传代细胞生长的 PEDV-G1 株，48 小时即可判定。经研究证实本方法检验准确、可靠、具有较高的敏感性，可用于流行病学调查。
4 免疫荧光法
直接免疫荧光法（FA）和间接免疫荧光法（IFA）是比较可靠的检测 PEDV 的特异性诊断方法，目前应用也较为广泛。
崔现兰等应用直接免疫荧光法（FA）检查病猪小肠的冷冻切片和小肠抹片，对PEDV 人工感染仔猪的检出率为 91.4%，电镜观察阳性率为 47.8%。应用间接免疫荧光法（IFA）对 PED 阳性猪血清的阳性检出率为 89%。林志雄等用适应于 Vero、pK15 等传代细胞的 PEDV-Gl 株建立直接免疫荧光法。用该方法检测 155 份分别来自 6 个猪场的患有严重腹泻、呕吐和死亡的仔猪的肠黏膜样品，检出率为 52%（81/155），同时用血清中和试验证实该6 个猪场的仔猪被 PEDV 感染过。应用哈尔滨兽研所的荧光抗体方法作为对照，阳性符合率达 95%（19/20），阴性符合率达 90%（9/10）。此方法不和猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应，证明该方法具有较高的准确性和特异性。朱维正等将间接血凝试验与间接免疫荧光法（IFA）比较后认为 IFA 法更具敏感性，检测效果更为理想。
5 免疫电镜法
由于 PEDV 与 TGEV 同属冠状病毒，且形状非常相似，所以二者在普通电镜下无法进行区别，因此需要采用免疫电镜法（IEM）进行区分。IEM 法既可用已知的 PEDV 高免血清来检测未知抗原，又可用已知的 PEDV 抗原来检测未知抗体。王继科等将抗原和抗体分别经 10 000 rpm 离心，免疫复合物又经 12 000 rpm 离心，最后在电镜下直接观察到了典型的病毒粒子形成的免疫复合物，建立了具有三次筛选作用的改良的 IEM 法，具有简便、直观、快速和定性正确等优点。但该方法由于需要使用电镜设备，所以并不适合于大规模诊断和临床诊断。
综上所述，随着分子生物学研究的不断深入，各种分子生物学技术的不断成熟，近年来PED 的诊断方法也得到了很大的改进，但由于受到仪器设备的限制以及天然 PEDV 的人工培养技术难度的制约，使很多方法仅限于实验室诊断阶段，还不适用于大规模的生产实践。目前已知的各种诊断方法在实际工作中各有优缺点，应结合实际情况具体应用，互相借鉴，取长补短，定会收到理想的效果。
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