猪肺炎支原体（MHYO）的病原DNA的检测
熊炜 四川农业大学
1.DNA探针技术
DNA探针技术是一种较早被建立的分子生物学检测技术。 1989年，Stemke将 MHYODNA的Ec0RI酶切片段克隆M13mp19，用重组产物作为探针检测MHYO。该方法敏感性高，特异性弱，与絮状支原体有交叉反应。Ahrens等用355标记MHYo基因文库中一个1.3kb的DNA片段，作为探针通过点杂交检测感染牛和猪的支原体，检测结果显示，该探针具有特异性。Futo等用32P标记与MHYo:洲A互补的寡聚脱氧核普酸制作DNA探针，检测了BALF和病肺组织等样本，其敏感性和特异性都很高，其敏感性比放射性同位素测定法高10倍。根据MHYo的16srRNA可变区序列，Johansson等设计出与之互补的特异性寡聚核普酸探针，然后用斑点杂交检测感染猪的肺组织中的MHYo。Kwon等用PeR扩增出长度为 520bp的DNA重复序列作为探针，采用地高辛标记后，以组织原位杂交法检测了自然感染MHYo猪的肺组织，该方法可以检测出病猪体内MHYo的分布情况。Boye等用荧光寡聚核昔酸探针对 165核糖体DNA进行定位，对猪鼻支原体、MHYO和猪滑液支原体进行种特异性鉴定。但是，用原位杂交法进行检测需要动物的剖解样本，并且检测时间相对较长，不适用于快速诊断，所以在日常兽医诊断中应用不算十分广泛。
2.PCR技术
PcR技术不但可以克服支原体培养难度大，血清学技术易产生交叉反应的缺点，还具有省时、特异性强、敏感性高和成本低等特点。多种PCR检测方法已被建立。早在1985年，Stemke等以MIYo16srRNA基因的一部分作目标序列，成功建立了直接PeR。随后Harasawa等报道，合成MHYo重复未知序列的引物，通过PCR扩增出520bP的目的片段，用合成的寡核普酸探针与扩增出的DNA进行印迹杂交鉴定，发现该PCR具有特异性，检测阂值为sng或1000CFU/ml，但是该研究没有对临床样品进行检测。
Artiushin等用根据MHYo独特的假设基因设计引物，通过PCR扩增456bP的目的片段，以该法对自然感染猪的鼻拭子和人工感染猪的气管分泌液、病变肺组织进行检测，检测阂值为1一10PgDNA。Stemke等以16SrRNA基因序列设计扩增产物为20ObP的引物，检测阂值为1000基因组，未对临床样品进行检测。Mattsson等以MHYO的 16srRNA基因序列设计引物，扩增片段为649bp，用该引物对感染猪的鼻拭子进行PCR检测。Blanehard等以假定的ABe运载体基因为目的基因，设计产物为156lbp的引物，提高了PCR检测的敏感性，检测阂值为500fg提纯的DNA，并检测了气管支气管洗液中的MHYo。
1997年，stemke等建立了一种用于MHYo检测的套式PCR，能直接检测出亚临床感染猪肺中的MHYO，其敏感性提高到相当于一个MHYo的DNA。 stark建立新的套式PcR，并第一次成功地从试验和田间条件下的空气样品中检测出MHYo。Banmeiste:等用嗅化十六烷基三甲钱法从猪的BALF中提取DNA用于PcR，该方法不仅特异性强，而且敏感性高，适于检测活猪呼吸道内的MHYO，不能培养的MHYO菌株也可用这种方法进行检测，因此，能迅速和可靠地获取一个猪群MHYo流行病学的资料。verdin等建立了一种套式PCR，用于检测活猪气管和支气管洗出液中的MHYO，发现所有MHYO毒株都能用这种套式PCR进行检测，和从呼吸道分离的其它病原没有交叉反应，检测阂值lfg。
eazsamigzia等用套式PeR检测支气管拭子中的MHYO，并对检出率与EP样肺部损伤之间的关系进行分析，发现两者有显著的相关性。earon等根据MHYo的基因序列设计引物，扩增产物分别为948bp和580bP，检测了鼻拭子、BALF和肺组织，检测阂值分别为到soPg和o.sngDNA，并且还用两对引物进行了多重PcR扩增。
2002年，Kruth等以独特的假设基因序列设计引物，通过套式PCR扩增出240bP的产物，检测了气管一支气管洗液和支气管肺泡洗液中的猪肺炎支原体，检测闭值为0.5-1。2004年，Dubosson等通过巢式分别扩增MHYPI一03一950重复序列和1-141片段假定ABC运载体基因的部分序列，产物为808bp和706bP，对支气管拭子进行了检测，检测闭值为lfg[9，]。2006年，st砍enbo笔等以多重PeR扩增猪肺炎支原体16SrRNA基因，产物为l000bp，灵敏度达lpg，但未检测临床样品。2007年，eai等用标准PeR扩增16sl.RNA基因，产物大小为649bp，对肺组织进行了检测，检测阂值为0.18cFu/g。
Castro等对MHYO的基因组中含有可变数目串联重复序列的编码基因序列进行分析，以评价其可变的程度、和抗原性之间存在的可能关系以及作为菌株分型PcR分析基础的潜能，发现特征性可变数目串联重复序列相对稳定，其大小为菌株特异性的，研究者建立了一种以该序列为基础的PCR，用于菌株鉴定、EP的诊断、菌株分型和区分免疫动物中的流行野毒猪与疫苗株。Mayo:等建立多位点序列分型用于分析猪肺炎支原体，结果显示，受感染的农场都只和一个MHYO克隆有关，并且大多数情况下农场之间存在不同克隆，但是地理位置相近或有接触的农场的克隆一致。
群体分析表明，猪肺炎支原体有重组现象，在分析毒株的有限克隆中表现出明显的多样性。用基因adk、rPoB和tiPA对MHYO进行多位点序列分型似乎足以从临床样本裂解液直接扩增目的基因以进行流行病学调查，而不需要进行菌株分离。此外，Artiushin等用随机引物PcR分析野毒株时发现该PCR可用于强弱毒株的区分，可用于区分强弱毒株的基因已被证实。
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