实验室消毒方法与效果评价

    摘要：近几年来，实验室安全已经越来越被国家重视，实验室消毒方法也层出不穷。笔者所在的实验室规定了兽医实验室消毒的基本方法以及实验室环境消毒、实验室器材消毒、实验室物品消毒、实验室工作人员和污染物等消毒方法与消毒效果评价标准，这为规范实验室消毒工作提供了相关依据，为兽医实验室工作人员的生物安全提供了技术保障。

    1 实验室的消毒方法

    1.1 物理消毒法

    是指利用物理因素杀灭或消除病原微生物及其他有害微生物的方法。主要包括射线消毒法和热力灭菌法。

    1.1.1 射线消毒法

    射线消毒法主要包括紫外线消毒和电离辐射消毒，可用于一次性医用塑料制品的批量灭菌。应用较多的是紫外线消毒。紫外线穿透力较弱，普通玻璃、尘埃、纸张等均能阻档紫外线，一般用于手术室、病房、实验室的空气消毒及物理表面消毒。紫外线空气消毒效果与房间面积、紫外线灯功率大小、灯具数量、照射时间、空气温湿度及物理表面洁净度有直接关系。一般紫外线灯波长200nm～300nm具有杀菌作用，以250nm～260nm最强，可导致微生物的变异或死亡。悬吊式紫外线灯平均功率为1.5W/m³，照射时间不低于30min。紫外线可损伤皮肤和角膜，应注意个人防护。电离辐射消毒法包括X射线、γ 射线和加速电子等，对各种微生物均有致死作用，多用于一次性医疗用品、生物制品等的消毒，但操作复杂，成本相对较高。

    1.1.2 热力灭菌法

    热力灭菌法主要包括干热灭菌法与湿热灭菌法。其原理是利用热力、光照、辐射等物理作用，破坏微生物细胞，导致其死亡。干热灭菌法包括干热燃烧灭菌法和干烤灭菌法，可用于不耐湿的物品。焚烧法适用于能在焚烧炉内焚烧的物质，适用于某些特殊感染、尸体或废弃的污染物等。湿热灭菌法包括煮沸灭菌法、流通蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌法，高压蒸汽灭菌法传热快，穿透力强，可用于耐高温、高压、高湿的物品，可用于各类器械、医用敷料、培养基等物品的灭菌。

    1.2 化学消毒法

    化学消毒药物可作用于微生物和病原体，使其蛋白质变性，失去正常功能而死亡。常用的有氯消毒剂、碘类消毒剂、氧化消毒剂、醛类消毒剂、酚类消毒剂、醇类消毒剂、季胺类消毒剂等。其中，氯类、醛类消毒剂属于高效消毒剂，具有腐蚀和漂白作用，可用于物体表面和皮肤消毒。臭氧可用于空气消毒。醇类、碘类消毒剂属于中效消毒剂，一般用于医疗护理器、皮肤和黏膜的消毒。季铵盐、胍类消毒剂属于低效消毒剂，可用于皮肤、黏膜、物品表面及地面等消毒。因其属于阳离子表面活性剂，不得与阴离子表面活性剂合用。

    1.3 生物消毒法

    1.3.1 生物消毒剂

    生物消毒剂是指用植物提取物、生物酶等制备的具有体外杀菌作用的生物制品。主要包括天然植物提取物、煎煮物、生物酶类等的生物活性物质。其特点有：杀菌作用可靠，性能温和，无刺激性；低毒，不污染环境；无易燃性，使用和储存运输安全，但杀菌谱有限。

    1.3.2 生物学消毒法

    生物学消毒法是利用生物氧化和生物热原理来杀灭或消除病原微生物的方法。在自然界中，有的生物在新陈代谢过程中，可利用嗜热细菌繁殖时产生的热，形成不利于病原微生物存活的环境，从而抑制或者杀灭细菌繁殖体、病毒、寄生虫虫卵等微生物，主要用于污染的饲料、粪便、污水、垃圾及其他废弃物等的消毒处理。粪便、污物等采用此法消毒后不失去作为肥料的使用价值，方法简便，比较经济，适于在生产中应用。

    2 实验室消毒分类

    2.1 实验室环境消毒

    2.1.1 自然通风

    可自然通风开窗换气，条件允许时采用排风扇机械通风。

    2.1.2 紫外线消毒

    紫外线灯可直接照射，要求≥1.5W/m³，照射时间在30min～60min；紫外线灯离物体表面不宜超过1m，照射过程中人员不得出入。紫外线灯管表面要保持干净，每1周～2周用纱布或棉球擦拭1次。

    2.1.3 臭氧喷雾消毒

    对于在空气中飘浮的细菌，臭氧灭菌浓度为4mg/m³～8 mg/m³。对物体表面沉降菌落，臭氧灭菌浓度为20mg/m³～30mg/m³，相对湿度60%～80%，密闭门窗2h。

    2.1.4 无菌室消毒

    无菌室在使用前后可直接用紫外线照射30min～60min。或密闭无菌室门窗，臭氧喷雾消毒，灭菌浓度为20mg/m³～30mg/m³，相对湿度60%～80%，密闭门窗2h。消毒过程中人员不得出入。

    2.2 器材消毒

    2.2.1 玻璃器皿的消毒

    消毒吸管时，先将吸管口塞入少许脱脂棉，松紧适宜，而后用牛皮纸包裹。试管或三角烧瓶用纱布棉塞将管口塞好，外面用纸张包好。烧杯可直接用纸张包扎。包装好的物品用干热消毒灭菌或压力蒸汽灭菌即可。

    2.2.2 金属器械的消毒

    用过的手术刀剪、镊子、止血钳等应先用超声波清洗干净，然后放入有洗涤剂的水中煮沸消毒15min，再用清水、蒸馏水将其冲净，最后煮沸15min或干热消毒备用。

    2.2.3 橡胶制品消毒

    污染的橡胶塞、吸头等可用洗涤剂溶液煮沸15min～30min，然后清水洗涤沥干后压力蒸汽灭菌处理后备用。

    2.2.4 搪瓷器皿的消毒

    将方盘、托盘等搪瓷器皿浸泡在1%漂白粉澄清液中1h，然后用洗涤剂溶液刷洗，再用清水洗净后备用。

    2.2.5 接种环、涂布棒的消毒

    接种环、涂布棒在使用前后要进行火焰烧灼消毒。

    2.3 物品消毒

    2.3.1 工作服消毒

    普通工作服用洗涤剂70℃以上温度在专用洗衣机内洗30min，再用清水漂洗。可能接触人畜共患病的工作服用含有效氯500mg/L的消毒剂浸泡30min，再用洗衣粉溶液洗涤30min～60min，最后用清水漂洗干净。工作服污染有病原体时，须经121℃、20min压力蒸汽灭菌处理后，再用洗衣粉溶液洗涤30min～60min，最后用清水漂洗干净。

    2.3.2 培养基的消毒

    一般基础培养基用121℃灭菌15min～20min；含糖培养基常采用115℃、10min～15min压力蒸汽灭菌。鸡蛋、血清培养基及其他不耐热的培养基可采用流动蒸汽灭菌法，80℃～100℃灭菌30min，每日1次，连续3d。含有尿素、血清等不耐热物质的培养基，还可用过滤除菌法进行灭菌。

    2.3.3 塑料用品的消毒

    重复使用的耐热塑料用品可浸入洗涤剂溶液煮沸15min～30min，然后清水洗涤，沥干后进行压力蒸汽灭菌。不耐热的塑料器材可在有效氯浓度为0.2%～0.5%的消毒剂中浸泡60min，然后用清水洗涤沥干。一次性塑料耗材（包括PCR管、离心管、移液枪头等）按照使用说明进行使用，使用后直接消毒处理。

    2.4 工作人员的消毒

    工作人员是传播病原微生物的重要媒介，做好日常消毒在工作中是非常重要的，尤其是手的消毒更为重要。为了节省时间，实验室最好选用免洗消毒液或配备装有 75%乙醇速干消毒剂的洗手消毒器，以快速清除手部的细菌及病毒，避免疾病的传播。个人防护装备可采用一次性防护服，保证工作人员的安全。

    2.5 污染物的消毒

    2.5.1 实验台面或地面的消毒

    正在做实验时，一旦微生物污染了实验台面或地面，应立即停止实验操作，快速进行污染物的消毒处理。首先使用含氯吸湿材料覆盖污染物，然后根据目标微生物选择有效消毒剂作用30min，将吸湿材料与实验样品一起小心放入污物袋中焚烧处理。

    2.5.2 污染物敷料桶的消毒

    污染物敷料桶如每天使用，要每天消毒1次。将桶内污物倒去后，用0.2%过氧乙酸溶液喷雾消毒，放置30min。桶内倒出的污敷料按废弃物处理。

    3 消毒效果检测

    3.1 空气消毒效果的评价

    3.1.1 采样时间

    消毒前采样及消毒后采样。消毒前采样的目的是为了了解消毒前空气中微生物水平；消毒后采样目的是为了了解消毒后空气中微生物水平。消毒前采样应关好门窗，在无人走动的情况下，静止10min后采样。消毒后采样一般应选择在消毒灭菌处理完成之后的时间段，按预定计划进行常规检测，定期、定时对空气进行样品采集。
    
    3.1.2 采样空气消毒效果评价指标

    评价指标有空气中的自然菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌、溶血性链球菌等。按照采样器说明进行采样，采样结束后，采样培养皿置于37℃温箱内培养24h～48h，观察结果并记录培养皿上的菌落数。

    3.1.3 菌落数计算

    每立方米菌落数＝（培养皿菌落数×1000）/（流量×采样时间）。

    3.1.4 效果评价

   （1）细菌总数根据不同空间空气细菌总数的国家卫生标准来判定其消毒是否合格。

   （2）杀灭率＝（消毒前菌落数－消毒后菌落数）/消毒前菌落数×100％。该方法不适合洁净室内空气采集，结果误差大；作为空气消毒方法考核误差也较大。由于使用简便、经济，主要用于基层。

    3.2 物体表面消毒效果的评价

    3.2.1 微生物学指标评价

    物体表面消毒效果的微生物学指标包括细菌总数及大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等。

    3.2.2 采样时间

    在物体表面经过消毒之后进行采样，并以消毒前同一物体表面同一部位附近作为对照样品，计算其杀灭率。

    3.2.3 采样及培养方法

    3.2.3.1 压印法

    将营养琼脂按说明煮沸灭菌后倒入无菌培养皿内，并使琼脂培养基高于培养皿1mm～2mm，待琼脂冷却后，将培养皿上的琼脂培养基直接压在被检物体表面10s～20s，然后盖好培养皿，在37℃温箱中培养24h～48h，观察结果，计算菌落数。

    3.2.3.2 棉拭子法

    消毒前采样。被检物体采样面积小于100cm²时，应取物体的全部表面；采样面积大于100cm²时，应连续采集4个样品，面积合计 100cm²。用5cm×5cm的标准无菌规格版，并放在被检物体表面，将无菌棉拭子在含有无菌生理盐水的试管中浸湿，并在管壁上挤干，对无菌规格板框定的物体表面进行涂抹采样，来回均匀涂抹10次，并随之转动棉拭子。采样完毕后，将棉拭子放入装有生理盐水的试管管口，剪去与手接触的约1cm棉拭子，剩余的棉拭子留在试管内，充分振荡混匀后待检。

    消毒后采样。在消毒结束后，与消毒前同一物体表面附近部位进行相应采样。采样与消毒前一致。将消毒前后样本尽快送检，进行活菌培养计数及相应致病菌与相关指标菌的分离和鉴定。

    3.2.4 检验方法

    细菌总数检测采用菌落计数法，致病菌的检测主要检测大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等。

    3.2.5 评价指标

   （1）细菌总数。小型物体表面结果计算用菌落形成单位来表示。

    细菌总数＝平板上菌落平均数×稀释倍数。采样面积大于100cm²的物体表面结果用细菌总数表示。

    细菌总数＝平板上菌落×稀释倍数 / 采样面积（cm²）。

   （2）杀灭率＝（消毒前菌落平均数－消毒后菌落平均数）/ 消毒前菌落平均数×100％。

    3.3 皮肤黏膜和手消毒效果的评价

    3.3.1 微生物学指标

    皮肤黏膜和手消毒效果的微生物学指标包括细菌总数和一些致病菌（大肠杆菌、葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和沙门氏菌等）。

    3.3.2 采样时间

    在消毒后立即采样，也可在消毒前采样作为细菌的杀灭率对照。

    3.3.3 采样方法

    3.3.3.1 手的采样

    被检者五指并拢，操作者用浸有生理盐水棉拭子脱液后在被检者双手指屈面从指根到指端往返涂擦2次（一只手涂擦面积约30cm²），并随手转动棉拭子采样，将棉拭子放于10mL生理盐水的试管管口，剪去操作者手接触部位棉拭子，采样部分留在试管内，立即送检。

    3.3.3.2 皮肤黏膜采样

    将直径为5cm×5cm的标准灭菌规格板，放在被检皮肤黏膜处，用浸有生理盐水的棉拭子脱液后在规格板内横竖往返涂擦5次，并随之转动棉拭子，将棉拭子投入装有无菌生理盐水的试管管口，剪去操作者与手接触处，其余棉拭子留在试管内，立即送检。

    3.3.4 评价指标

    将采样管在混匀器上振荡20s，用无菌吸管取1.0mL 的待检样品拌种于灭菌平皿内，边倾注边摇匀，倒置于37℃温箱中培养48h。计算菌落数。

   （1）细菌总数（CFU/cm²）＝平皿上菌落数×稀释倍数 / 采样面积（cm²）。

   （2）杀灭率＝消毒前菌落数 - 消毒后菌落数/消毒前菌落×100％。

    3.4 浸泡消毒液效果的评价

    3.4.1 方法与步骤

   （1）用无菌吸管吸取1mL浸泡消毒液加入9mL稀释液试管内。当消毒不同时，所用的稀释液也不同。对醇、氯、醛类消毒剂，可用含有中和剂的营养肉汤；对碘类、酚类＋洗涤剂、氯制剂＋洗涤剂、季铵盐类及低浓度双胍类消毒剂，可用营养肉汤＋3%吐温80。

   （2）将以上稀释10倍的消毒剂混合液用50滴/mL无菌滴管吸取，接种于营养琼脂平板上，共滴2块平板，再用1块滴加蒸馏水的平板做对照。此项工作应在采样后1h内结束。

   （3）培养。将做好的营养琼脂平板放在37℃温箱内培养3d后可观察结果。

    3.4.2 结果评价

    在加入消毒液的2块平板上观察，如果1块或2块平板上有细菌生长，说明消毒液内有活菌存在。若仅有1个～2个菌落，说明消毒效果可靠，因为消毒剂的作用是消毒而不要求达到灭菌。若大于5个菌落，说明消毒效果不好。可按以下公式计算每毫升消毒液内存活的菌数。

    1mL消毒液内存活菌数＝菌落生长数/平皿×10×5。

    式中，×10是因为采取的10倍稀释消毒液；×5是由于采取10滴消毒液相当于1/5mL。

    4 结论

    随着实验室生物安全问题越来越被国家工作人员重视，做好实验室消毒和灭菌工作是保护实验室工作人员不被病原微生物和废弃物感染的重要环节。在建立健全实验室规章制度和认知、熟悉过程中，加强生物安全实验室的个人防护、实验室的正确管理及突发不可知生物实验安全操作教育工作，定期进行实验室生物安全培训，强化消毒灭菌意识，选择经过验证的高效、安全的消毒技术方法与正确的消毒效果评价，是保障实验环境、实验室工作人员生物安全身心健康必不可少的内容。

    第一作者简介：于凤芝，1972年出生，女，高级实验师，主要从事畜牧兽医研究工作。

   （于凤芝 关文怡 乔立东 雷莉辉 艾君涛  北京农业职业学院）

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