布鲁氏菌病及动物疫苗的研究进展

    摘要：近年来，随着我国畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病发病率有上升的趋势。借鉴已消除该病国家的防控和净化措施，疫苗的免疫预防是关键因素。除了传统的细菌培养疫苗牛种S19株、羊种Rev.1株、猪种S2株以及牛种RB51株，利用基因工程技术针对布鲁氏菌侵害机体的过程及其免疫抗原物质构建的新兴疫苗得到不断发展。笔者对布鲁氏菌的特点、危害、致病机制及动物疫苗应用进展进行介绍。

    布鲁氏菌病（简称布病）是一种严重的人兽共患传染病，致病菌为布鲁氏菌（Brucella），除了可以通过皮肤、黏膜感染，还可通过消化道和呼吸道感染。我国将其列为乙类传染病，世界动物卫生组织将其列为B类法定传染病。

    1 布鲁氏菌的特点

    布病是一个流传久远的疾病。据考证，公元前750年，古埃及人的尸体显示有其生前患有布病的症状（明显的骨关节炎症及损伤等）。1887年，英国军医David Bruce从死于热性病的士兵脾脏中分离并发现布鲁氏菌。此间，经过人类不断研究，完善了对该菌的认识。布鲁氏菌长0.6μm ～1.5μm、宽0.5μm～0.7μm，为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，主要寄生部位是动物细胞内。无鞭毛和芽孢，一般无荚膜，具有革兰阴性菌典型的3层膜结构，即肽聚糖层外有特殊的3层外膜结构，由内向外依次为脂蛋白、脂质双层和脂多糖。根据外膜上的脂多糖（lipo-polysaccharides，LPS）是否含有O链结构，可以将布鲁氏菌分为光滑型（smooth，S）和粗糙型（rough，R）。其中，R型是O链缺失型，在一定条件下，由于参与LPS合成基因的突变和缺失可使S型和R型之间相互转换。根据对宿主的偏好，布鲁氏菌属分为6个经典种，分别为羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊附睾种。随着研究范围的扩大，又相继鉴定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鳍型）、B.ceti（鲸型）以及 B.inopinata（分离自人体）。我国流行的主要是羊、牛和猪种布鲁氏菌，其中羊种最为多见，且病情较复杂、严重。

    2 致病机制及研究现状

    布鲁氏菌侵入机体后，到达的第一个免疫器官是淋巴结，在这里吞噬细胞会将其吞噬。如未将其杀灭，则会在胞内大量繁殖，使吞噬细胞破裂而解体，大量细菌进入淋巴液和血循环。此时机体免疫系统启动，宿主出现发热。当细菌再次到达淋巴结等器官，宿主体温恢复。循环往复，临床上称为“波浪热”。人感染布鲁氏菌后常表现为发热和关节疼痛等症状。如在急性期治疗不彻底，转为慢性，更有甚者会丧失劳动能力。动物感染后，母畜常出现流产、不孕，公畜出现睾丸炎，影响家畜生产繁殖能力以及畜产品的质量安全。

    鉴于布病对人类健康及畜牧业的严重威胁，防治工作刻不容缓。其中，疫苗的研发和应用是关键。随着对布鲁氏菌致病机制及机体免疫应答程序的深入研究，特别是近年来基因研究技术的发展和普及，极大促进了布病疫苗研制工作。自2002年羊种16M菌株的基因组序列公布后，其他布鲁氏菌株的测序已经完成。各菌株间有很高的序列一致性，但存在不同程度缺失、插入、倒置和移位现象。除猪种3型686株含1条染色体外，其余布鲁氏菌中都含2条环形染色体。染色体Ⅰ约2.11Mbp，GC含量为57.2%；染色体Ⅱ约1.18Mbp，GC含量为57.3%。

    脂多糖（LPS）和外膜蛋白（outer-membraneprotein，OMP）是机体免疫系统识别布鲁氏菌的主要抗原。LPS的O链是布鲁氏菌的活性部分，参与抑制宿主细胞的凋亡，从而逃避宿主免疫系统。当S型菌株突变为R型菌株意味着其毒力的下降。目前，血清学是常用的检测布鲁氏菌的方法，如虎红平板凝集实验（RBPT）、标准试管凝集实验（SAT）和补体结合实验（CFT）。这些方法都是基于LPS的O链的抗体检测，由于R型布鲁氏菌疫苗免疫时，机体不会产生针对O侧链的抗体，故血清学方法可区分R型布鲁氏菌疫苗的自然感染和疫苗免疫。巨噬细胞与胎盘滋养层细胞是布鲁氏菌感染的主要靶细胞，它还能在树突状细胞中也可生存。区别于其他病原微生物，布鲁氏菌不具备经典的毒力因子，且在两种宿主中会产生不同的基因子集（sub-sets of genes），致使布鲁氏菌的致病机制更为复杂多变。目前，已鉴定分离的毒力因子有脂多糖、外膜蛋白、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等应激反应蛋白。如此繁多的毒力因子，可降低细胞递呈能力，抑制细胞凋亡。

    3 疫苗分类

    因减毒活疫苗可以刺激机体的细胞免疫系统，产生良好的免疫保护效果，故在实际生产中应用广泛。经典的布鲁氏菌动物疫苗有S19和Rev.1。我国常用的是S2、M5和S19，南美的部分国家和美国多使用RB51。

    3.1 传统细菌培养的疫苗株

    根据疫苗株的获得途径不同，可将其划分为3类：①通过细菌的传代培养，直接筛选出弱毒活菌苗，如S19、Rev.1和M5等；②根据细菌特性利用生物化学手段将其灭活，后期加入佐剂制成的灭活苗，如45/20、H38等；③在传代培养中筛选出的自然突变株，如RB51。根据疫苗株来源不同，又可分为光滑型疫苗和粗糙型疫苗。

    3.1.1 常见的光滑型疫苗

    S19（B.abortus strain 19）疫苗是在新泽西某牛场的牛奶中分离，经实验室传代培养1年以上自然减毒获得。因该菌株毒力较强，有感染人和使母畜流产的风险，最终被美国农业部禁用。20世纪60年代我国引进该疫苗株。该菌株是光滑型，可以持续刺激机体产生细胞免疫，提供保护力，但无法区分疫苗免疫和自然感染。

    Rev.1（B.melitensis REV.1）疫苗是Elberg等1957年从B.melitensis 强毒株6056血清中分离培养得到的，具有链霉素抗性。该菌株在适当条件下毒力可以完全恢复。较之S19有更高的流产率，同时意味着其有更完整的抗体特征刺激机体免疫系统，从而获得更好的保护力。

    M5疫苗是1962年哈尔滨兽医研究所通过对B.melitensis强毒株M28连续鸡减毒获得。该菌株有S型变异为R型的不稳定性，目前仍用于山羊的免疫，免疫后可保护1年时间。

    H38疫苗是1964年Renoux等将马耳他布鲁菌53H38号强毒菌株的培养液，经福尔马林灭活后加入佐剂制成。属于S型，在山羊和绵羊应用效果较好，安全性高，但存在局部化脓现象。

    S2（B.suis strain 2）疫苗是1952年我国兽医药品监察所从猪流产胚胎中分离得到的。该疫苗株与S19和Rev.1相比毒力较弱，在牛、羊、猪等畜种都能产生良好的免疫效果。丁家波等通过试验动物比较S2、M5和A19 3种疫苗株的安全性和免疫保护效果，得出S2除了具有良好的免疫保护力外，还具有更优良的安全性。

    3.1.2 常见的粗糙型疫苗

    RB51疫苗是S型牛种2308菌株经利福平和青霉素的反复传代获得的突变株，特点是在2308株编码糖基转移酶蛋白的wboA基因中插入一段IS711序列。它在美国和南美地区被广泛使用，但该疫苗的使用需严格控制剂量和免疫途径，否则会导致严重感染和母畜流产。

    45/20疫苗是1922年从患布病牛的体内分离后又在豚鼠20次传代培养得到的R型减毒灭活疫苗。免疫保护力较好，但存在R型与S型变异的不稳定性，逐渐被淘汰。

    3.2 基因工程疫苗

    利用基因工程（蛋白质工程）技术对现有的优质疫苗株进行改造培养出的工程菌株、重组质粒或代谢产物（蛋白质）等称为基因工程疫苗。如美学者利用RB51菌株构建了超量表达Cu/Zn超氧化物歧化酶的重组株，优化原菌株的免疫保护力。此外，针对某基因区插入、替换或剔除特定序列从而构建突变株也属于此类。

    3.2.1 DNA疫苗

    常见的DNA疫苗有p39（T淋巴细胞抗原）、L7/L12（核蛋白）、Omp31（外模蛋白）、Omp25（外模蛋白）、GroEL（热休克蛋白）等。制备的原理是把含有目标抗原基因的重组质粒直接注射或感染动物细胞，诱导机体产生全面、持久的免疫应答。DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应较蛋白质疫苗要强烈，有良好的研究前景。

    3.2.2 蛋白质疫苗

    利用含有目标蛋白的基因序列在真核或原核细胞中表达产物（蛋白或多肽）制成的蛋白质疫苗，又称亚单位疫苗。筛选最佳抗原是重组蛋白质疫苗的研究关键，后期常与其他佐剂相联合使用，使机体产生更强烈的免疫应答。蛋白质疫苗的主要缺点是自身在机体内无法复制，且生产工艺复杂、成本高，故尚未普及。

    3.2.3 标记疫苗

    为区分疫苗免疫和自然染病，利用基因置换、删除或缺失技术构建的工程菌，称为标记疫苗。如将抗卡那霉素基因置换Rev.1菌株的p39基因（产物为胞质结合蛋白），获得Rev.1-Δp39 疫苗株；剔除Rev.1 bp26序列的CGV26或者CGV2631获得的疫苗株等。我国学者对M5-90菌株进行同源重组构建的基因缺失株也属于标记疫苗类。

    较之传统的疫苗，基因工程疫苗既保留了原有免疫活性，又解决了残余毒力强的安全性问题，并可区分疫苗免疫和自然染病。布鲁氏菌侵入机体产生的免疫应答及其逃避巨噬细胞的系统研究成为基因工程疫苗的发展钳制因素。

    4 小结

    随着我国畜牧业的集约化发展，布病的防治工作不容忽视。借鉴国外的防控和净化经验，当前疫苗的预防作用意义重大。如何研制出安全性、稳定性及免疫效果各方面都均衡的疫苗是未来的发展方向。通过政府管理部门及科研工作者等各方的努力，我国布病一定会得到有效控制。

   （葛瑞华 龚小林 潘乳玲  江西省南昌县动物疫病预防控制中心）

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