生物发酵法处理病死鸡微生物含量变化的追踪监测
目前国内的肉鸡和蛋鸡生产正在由原来的小型、分散型经营向中大企业经营方向发展，在生产大量鸡肉、鸡蛋的同时，还产生大量鸡粪、废水、死亡鸡等废弃物，如对其处理不当，任意倾倒、排放或堆积，将对环境造成严重的污染。被丢弃的病畜禽尸体其所带的细菌、病毒会随空气或其他途径迅速传播扩散，如果是重大动物疫病或人畜共患病，会造成重大动物疫情或人畜共患病发生，人畜生命安全就会受到威胁，经济就会受到严重损失，影响畜牧养殖业的发展。病死畜禽的无害化处理是消灭传染源最有效和最彻底的措施，特别是当前正值重大动物疫病防控的重要阶段和食用农产品质量安全水平全面提升的关键时期。
对病死畜禽处理的基本原则是防止有害病原微生物的扩散与传播。目前，比较常用的处理方法包括深埋、焚烧、工业油脂提炼和好氧发酵等。比较了病死畜禽无害化处理的几种方式的特点，深埋虽然操作方便，但深埋处理一般是针对无机物含量高于60%的废弃物，而病死畜禽主要以有机物为主，直接填埋会造成有机物资源浪费，还会带来二次污染；焚烧处理的减量化、无害化最彻底，但由于其高昂的设备投资成本及二恶英污染而限制了焚烧厂的建立；工业油脂提炼法因油脂提炼病死畜禽的生物安全性不高，现在很多国家已经限制利用病死畜禽进行油脂加工提炼；对于病死畜禽好氧发酵的处理方式，美国一项针对专业人士的调查显示，51%认为该方式性价比较高，46%认为它可以提高生物安全性，68%认为容易操作，44%认为效果比预期还好，只有0.6%认为它不成功。可见，在美国以好氧发酵处理病死畜禽的方式已获得了较好地评价。综合比较这几种处理方式，好氧发酵法可以同时达到廉价和无害化处理的要求，符合环境保护与资源再生的理念，是病死畜禽无害化处理的主要发展方向。
生物发酵法处理病死畜禽后，发酵堆残余的病原微生物数量、种类有何变化尚未有具体的追踪研究，因此，目前，对生物发酵法无害化处理病死畜禽技术进行效果追踪监测及评估势在必行。
1材料与方法
1.1材料
PCA细菌计数培养基(GB)、荧光RT-PCR/RT-PCR检测试剂盒。
1.2实验方法
1.2.1样品采集
本次试验共对3组堆体的样品进行采集，分别为A组、B组、C组，结合生产操作，于埋入病死鸡前0、7、14、21d分别取样，取样位置按照堆体对角线布置5个点，每个采样点分表层3~5cm、中心20~30cm、深部40~50cm进行取样，每个样品200g左右，塑料袋密封。本试验每组每次各采集15份样品，每层采集了5份样品，共采集了180份样品。为了更好的追踪发酵堆微生物的变化情况，对A组一直追踪采样到第35d，每次采集15份样品，每层采集了5份样品。在病死鸡埋入前样品的采集，遵循操作安全、无菌，采样由小到大、病变与健康组织兼顾的原则。脾、肾、淋巴结可以采取完整的一个。肝、肺等可以采集病变和健康组织交界处，至少5×5cm大小。肠或气管，采集带病变部位至少5cm长。
1.2.2病毒检测
对采集的样品经过常规处理后，进行病毒检测。检测的病毒种类、检测方法和鉴定方法见表1。
1.2.3细菌计数
（1）对采集的样品进行菌落计数，方法按照GB/T4789.28-2003进行。样品的稀释：称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000~10000r/min均质1~2min，制成1:10的样品匀液；用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。依次进行制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1次1ml无菌吸管或吸头；根据对样品污染状况的估计，选择2~3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照；及时将15~20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。（2）培养：待琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃培养48±2h。菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。
2结果
2.1荧光RT-PCR/RT-PCR检测样品中病毒
生物发酵法无害化处理病死鸡对病毒的杀灭情况检测结果，见表2。
2.2细菌数
通过细菌计数可知，制堆前A、B、C组样品CFU/g分别为5.34×1008、4.26×1010、3.57×1011，制堆后两组样品第7、14、21d的样品CFU结果见表3，A组第28d、35d的CFU结果见表4。
3讨论
（1）生物发酵法处理病死鸡因其众多的优点受到国内外广大养殖户喜爱，如操作简单、不产生废气，对环境影响小等优点，但在实际应用过程中也存在一些不足的地方，例如要人工测量温度、湿度，及时控制发酵堆体的湿度、温度，以保证发酵效果。另外，如何进一步提高生物发酵无害化处理病死鸡的微生物杀灭效果，并进行推广，有待于进一步研究。（2）由表2可知，仅在B组检出的传染性支气管炎病毒在经过21d的发酵后被杀灭。由表3可知，三组无害化处理堆经过21d的处理后，三组菌体含量均下降明显，含量的数量级非常一致，均达到6个数量级。据相关数据可知，lg肥沃土壤，如菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103~107个微生物。因此，此生物发酵法无害化处理病死鸡后，其微生物含量已仅仅相当于荒土等贫瘠土壤的微生物含量。由表4可知，由A组的后续跟踪实验可知，发酵堆在第21天的CFU最低，第28天和35天采集的样品CFU数量逐渐升高，因此，理论上此生物发酵法的发酵时间设计到第21天是微生物含量最少的发酵时间。
综上所述，说明采用此无害化方法处理病死鸡，其杀灭微生物的效果非常显著，并且发酵时间设计到21d，微生物含量最低。
（山东省动物疫病预防与控制中心，徐鸿，尹斐斐，刘丽平，徐聪，王世荣，王贵升，孙圣福，马慧玲，李玉杰，王苗利，陈静，田夫林）
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