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海南养猪研究所
海南罗牛山畜牧有限公司
罗牛山股份有限公司
本操作规程适用于猪的 0.5 mL 细管冷冻精液生产和作为技术操作检查的标准。严格按照本规程操作， 所制作的冷冻精液解冻后活力可达 0.3 级以上。
1人员职责
1.1采精员
熟练掌握公猪采精技术及后备公猪调教技术， 合理控制公猪采精频率， 能采集体积大、 密度高的精液。
1.2实验室人员
熟练掌握精液品质检查、 稀释液配置、 精液稀
释、 精液分装、 精液冷冻、 精液解冻和保存等试验技
术， 树立清洁、 无菌理念， 提供优质合格的冷冻精液。
1.3输精员
熟练掌握母猪发情鉴定技术，严格按照 10 cm适度深部输精技术操作规程进行输精，认真填写母猪配种档案卡， 保证母猪的受胎率和产仔数。
1.4公猪饲养员
根据公猪体况、 年龄等控制饲料饲喂量， 保证公猪正常性机能， 配合采精员的工作。
2实验室准备
2.1清理、 清洁实验室设备、 桌面、 地面， 保持实验室清洁卫生、 无灰尘， 无直射阳光， 无蚊蝇， 无刺激性气味， 室温维持在 20 ℃左右。注意通风换气， 禁止吸烟。
2.2进入实验室的工作人员需换上干净的工作服、鞋、 帽。
2.3器械消毒。烧杯、 过滤纱布、 玻璃棒、 镊子等采用高温干燥箱消毒； 0.5 mL 细管、 量筒、 温度计等洗净晾干后， 用紫外线照射 30 min 消毒。
2.4冷冻准备。备足制作和保存冷冻精液的液氮，检查液氮罐是否完好。 测量储备冷冻精液的液氮量，当液氮量降到二分之一至三分之一时，要及时补充液氮， 保存有冷冻精液的液氮罐， 其液氮量不得少于总容量的三分之一。
3 采精
参照 《人工授精技术操作规程》 中采精方法， 采用手握法采精， 取浓稠部分， 显微镜下检查精子活率。 鲜精活率要求不低于 0.7 级， 检查活率时要求载玻片和盖玻片都应 37 ℃预热。畸形率不能超过 18%。
4 0.5 mL 细管冷冻精液制作
4.1 配置稀释液
4.1.1 BTS液 每100mL双蒸水中加： 葡萄糖3.7g， ED－TA0.125g， 碳酸氢钠0.125g， 二水柠檬酸钠0.6g， 氯化钾0.075g， 抗生素 （ 青霉素∶链霉素=1∶1 ） 0.01g。共配300mL。
4.1.2 TCG-海藻糖液每 100 mL 双蒸水中加： 葡萄糖1.1 g， 柠檬酸1.48 g， Tris （三羟甲基氨基甲烷 ） 2.24 g，海藻糖 3.5 g。配 200 mL+50 mL 卵黄。
4.1.3 9%的甘油 TCG-海藻糖液取 20 mL TCG-海藻糖液加甘油 1.8 mL，配成含甘油 9%的甘油TCG-海藻糖液。
4.2 精液的检查、 第 1 次稀释和运输
4.2.1 鲜精。活力在 0.7 级以上， 密度达到密级方可使用。所谓密级是指显微镜下观察，精子充满整个视野， 精子之间所留空隙不足一个精子的长度， 这种密度每毫升精液中约含精子 3 亿个以上。
4.2.2 第 1 次稀释。采精过滤后用 BTS 液按体积作
1∶1 稀释。
4.2.3 包装与运输。 第 1 次稀释后的精液， 置于消毒后的玻璃瓶中，用纱布包裹，置于黑塑料袋或温箱中，交付运输。在运输过程中防止光线照射和剧烈震动， 运送时间不得超过 1 h。
4.3 在实验室处理精液
4.3.1 初次平衡。送到的精液置于 17 ℃冰箱平衡1～2 h， 视气温与运输时间而定。气温低， 运输时间长， 在 17 ℃冰箱中平衡 1.0～1.5 h 即可； 气温高， 则需平衡 2 h。
4.3.2 室内空调调整到最低温度 16 ℃。
4.3.3 离心浓缩。 从 17 ℃冰箱中取出经初次平衡的精液分装后置于离心管中，在离心机中以每分钟2 000 r 速度离心 8 min。
4.3.4 再稀释平衡。 取出离心管弃除上清液后余 1/4量体积， 使用 TCG-海藻糖卵黄液按体积比以 1∶1 作稀释， 将稀释精液置 0～4 ℃冰箱中平衡 2 h。使用含9%甘油卵黄海藻糖稀释液与平衡后精液按体积进行 0.5∶1 作稀释， 使甘油最终浓度为 3%。亦可用稀释精液量取 3%的甘油略作稀释后加入稀释液中，使甘油最终浓度为 3%， 或稍低于 3%。4.3.5分装。将含甘油的精液稀释液分装于 0.5 mL的塑料细管中， 用聚乙稀醇粉快速密封管口， 并将细管， 均匀置于冷冻支架上。
4.3.6第 3 次平衡。将分装好的细管再置于 0～4 ℃冰箱中平衡 1 min， 并在冰箱中加入冰块， 不覆盖细管， 使其降至 0～4 ℃。
4.4 精液的冷冻
将液氮倒入有盖的平底器皿中（目前使用旧水浴锅） ， 让液氮蒸发平静后， 从 4 ℃冰箱提取分批放入装冷却平衡细管精液的冷冻架，分次放置距离液氮面 3 cm 左右架上， 熏蒸 8～10 min， 使细管精液全部冷冻后装入液氮罐。
4.5 冻精的解冻
4.5.1 开起水浴锅调水温至 52 ℃。
4.5.2 开起精液检查恒温板，调整温度至 37 ℃， 将镜检精液的载玻片和盖玻片放在恒温板上加热至37 ℃待用。
4.5.3 先打开液氮罐，将装有冷冻精液的提桶提出至液氮罐颈口下， 用消毒的镊子夹取 1～2 支细管冷冻精液，迅速投入 52 ℃水浴锅中经 12 s 水浴解冻后迅速取出， 剪开两头封口挤出 1～2 滴已解冻的精液于载玻片上预热片刻， 盖上盖玻片， 在 150～400 倍显微镜上镜检。
4.5.4活力评定。在显微镜下观察到呈直线前进运动的精子的百分数， 评定等级。 记录其百分比， 0.3 级以下废弃不用。
4.5.5 凡评定为 0.3 级以上的精液， 方为合格精液，储存备用。
4.6输精
将装有精液的液氮罐、 2 个水浴锅、 显微镜、 解冻用具以及输精器械等设备移至输精现场。每头母猪每次输精用 8～10 支在 52 ℃下解冻的0.5 mL 细管冷冻精液加 28 ℃的 80 mL BTS 液稀释， 每一情期输精 3 次， 输精方法采用 10 cm 适度深部输精法。
4.7冻精制作结束的器械处理
集精杯、 烧杯、 量筒、 温度计、 玻璃棒、 解冻盒等试验器械用完之后， 立即用洗衣粉水洗净， 用清水冲洗 5～10 次， 再用蒸馏水冲洗 3 次， 然后对洗净器械进行消毒。
5 冻精的保存于管理
5.1 贮存冻精的液氮罐要勤检查， 当液氮量降到二分之一至三分之一时，要及时补充液氮。如发现贮存罐耗氮太快或罐壁出现白霜时，表明液氮罐保温性能丧失， 要及时转移冻精。
5.2 贮存的冻精每月进行一次全面的品质检查。
5.3 从液氮罐钩取冻精时， 动作要轻， 以防钩破冻精。
5.4 每年须清洗一次液氮罐， 更换陈旧液氮。清洗时， 先用中性洗涤液刷洗， 再用 40～50 ℃温水冲洗，晾干水分， 然后用 75%酒精消毒后使用。
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