猪水肿病的主要毒力因子
冯瑜菲 东北农业大学
兽医发现致猪水肿病大肠杆菌主要毒力因子为志贺毒素II型变异体和F18ab 菌毛。
1. 志贺毒素Ⅱ型变异体（Stx2e）
1971年，Schmmipfennig提出水肿病可能是由大肠杆菌产生的神经毒素引起的，该毒素类似于志贺氏痢疾杆菌神经毒素。1973年，Clugston提出大肠杆菌产生一种血管毒素，并称之为“水肿因子”（EDP），这种毒素能被硫酸铵沉淀，对热敏感，溶于碱而不溶于酸。1977年，Konowachuk H等人首次描述了Vero毒素。O’Brien 等报道了肠出血性大肠杆菌（EHEC）产生的志贺毒素，该毒素可以被抗志贺氏毒素的抗毒素中和，对Vero毒素和志贺毒素进行的理化性质和免疫原性的比较表明，Vero毒素和志贺毒素是同一种毒素。Scotland 等采用了Vero毒素1（VT1）和Vero毒素2（VT2）这样的名称，VT1与SLT-Ⅰ，VT2 与SLT-Ⅱ相互对应。
1988年，Cannon用致水肿病大肠杆菌产生的VT毒素对猪静脉注射，复制出了水肿病。Macleod DL等将提纯的毒素注射到健康仔猪静脉内，可以出现与猪水肿病完全相同的症状和损伤，此实验证明了毒素是水肿病的主要致病因子。此后，人们逐渐发现致水肿病大肠杆菌产生的VT毒素与志贺氏菌样毒素Ⅱ（SLT-Ⅱ）很相似，但又稍有差异，故把它命名为志贺毒素Ⅱ型变异体（Shige-like toxinⅡvariant，SLT-Ⅱv），因为其可致水肿病发生，现在通常把它称为Stx2e，该毒素对Vero细胞具有毒性作用，也可致小鼠死亡，并能引起血管损害而导致水肿。
志贺毒素包括志贺毒素Ⅰ型（Stx1）和志贺毒素Ⅱ型（Stx2）。Stx1的序列高度保守，其与Stx2的同源性仅为58%。Stx1由Stx1A和Stx1B两个基因编码产生，与痢疾志贺菌产生的志贺毒素只有一个氨基酸不同，二者具有相同的启动子。Stx2序列可变，存在几个亚型，包括Stx2v、Stx2vha、Stx2vhb、Stx2e和Stx2c等，其中Stx2e是引起仔猪水肿病的主要毒力因子，其与Stx2序列高度保守，二者同源性可高达91%。
Stx2e是由一个A亚基和五个B亚基共同构成的聚合体，A、B亚基分子量分别为33.05Ku和7.6Ku，均具有抗原性。编码Stx2e的特定基因存在于染色体上，Stx2e的结构基因含有两个开放性阅读框（ORF），两个核糖体结合位点（RBS），两个信号肽编码区及一个终止子结构。其操纵子全长为1980个核苷酸，由两个亚单位基因组成，即Stx2eA和Stx2eB，两个亚单位之间有一个15个核苷酸的非翻译区。Stx2eA位于242到1199核苷酸处，其中242到307核苷酸片段为前导序列；Stx2eB位于1214到1474bp处，其中1214到1270bp为前导序列。两个RBS分别位于第228位核苷酸处和1203位核苷酸处，它们分别对Stx2eA和Stx2eB的翻译进行控制。在Stx2e操纵子中，90~95（-35）和112~117（-10）是调控序列。在3’端核苷酸第1819~1839处可能是一个转录终止子。
Stx2e 与 Stx2 基因核苷酸序列之间的同源性可达 91%，其中 Stx2eA 与 Stx2A 同源性可达95%，这种同源性可以延伸到 A 亚单位基因上游 200 多个核苷酸，这说明 Stx2e 与 Stx2 具有共同的调节机制以及亲密的进化亲缘关系。Stx2eB 与 Stx2B 之间的同源性仅为 79%。Stx2e 可被 Stx2 的抗血清中和，但不能被 Stx1 的抗血清中和。
Stx2eA 亚单位包括 297 个氨基酸，分子量为 33.05Ku，是毒素的主要毒力亚单位，具有RNA-N 端糖苷酶活性，是毒素的酶活性部位，具有细胞毒性作用，主要通过 A 链上的 RNA-N-糖苷酶活性对真核细胞28S-rRNA的5′端432位的腺嘌呤的N端糖苷键产生特异的切除作用，使得延伸因子 EF-1 的氨基酰-tRNA 不能够与 60S 核糖体的亚单位进行结合，从而使细胞内蛋白质合成受阻，导致新陈代谢紊乱，最终导致细胞死亡。此外，A 亚单位的空间构型也可影响 Stx2e 的毒力和酶促活性。Schlossman 等人利用 X 射线衍射技术对 Stx2eA 的立体结构进行了观察，推测出第 167 位谷氨酸（Glu）残基及第 170 位精氨酸（Arg）残基对于维持其构象具有重要的作用。1992 年，Gordon 等人利用点突变技术修饰了 Stx2eA 基因，结果发现如果把第 167 位谷氨酸突变成天冬氨酸（Asp），其毒力会下降 104倍，酶促活性下降400 倍；如果把第 170 位精氨酸（Arg）突变为赖氨酸（Lys），其毒力下降 10 倍，酶促活性下降 5 倍；如果把第 167 位及第 170 位氨基酸同时突变去掉，其毒力会下降 106倍，酶促活性下降 1500 倍。2007 年，付海兵利用定点突变技术将 Stx2e 基因第 167 位谷氨酸及第 170 位精氨酸分别突变成为谷氨酰胺和亮氨酸，成功构建出了一株猪水肿病大肠杆菌 Stx2e 基因突变菌株，实验结果表明，突变菌株对小鼠胃肠等组织的损伤明显轻于野生株，而对 Vero 细胞的毒力可降至野生株的 1/500。
Stx2eB 亚单位不具有毒性，通过定点突变验证表明，对 Vero 细胞受体发挥作用的氨基酸即位于 Stx2eB 处。Stx2eB 能与猪的肠上皮细胞的特异性受体结合，使 Stx2eA 通过“脂流”进入细胞内，从而使 A 亚基发挥毒性作用。Stx2eB 的特异性受体包括球丙糖基神经酰胺（globotriosylceramid，Gb3）、球丁糖基神经酰胺（globotetraosylceramide，Gb4）以及半乳糖红细胞糖苷酶（galactosylgloboside，Gb5），Stx2eB 可优先与 Gb4 和 Gb5 结合，而与 Gb3 结合的能力较差。由于 Gb3 存在于 Vero 细胞、HeLa 细胞和仔猪小肠细胞上，Cb4 存在于 Vero 细胞和猪小肠细胞上，Gb5 仅存在于 Vero 细胞上，因此，Stx2e 对HeLa 细胞的毒性较弱，而对 Vero 细胞的毒性较强。另外，B 亚单位决定特异性，Ling H 等利用点突变技术，将第 65 位的 Gln 突变为 Glu，第 67 位的 Lys 突变为 Gln，结果表明，发生突变的 Stx2eB 亚基与 Gb3 的结合能力强于 Gb4，说明 Gb3 是 Gb4的替代受体（Tyrrell G J et al，1992；Ling H et al，2000）。Waddell T E 等研究了猪体内 Stx2e受体分布，结果表明，猪的眼睑、小脑、脑脊髓、肝脏、回肠、结肠等部位均可结合 Stx2e，并且除肝脏外的其他部位的静脉也可结合 Stx2e。利用单克隆抗体做进一步验证发现，Stx2e主要结合在这些器官组织的上皮细胞和血管平滑肌细胞上。目前已经有研究证明 Stx2e 可以遏制猪主动脉内皮细胞的蛋白质合成，这也证明了内皮组织有 Stx2e 的特异性受体。
2. F18ab（F107）菌毛
F18ab 菌毛是引起猪水肿病大肠杆菌的定植因子，是Rippinger P 等人在研究两株大肠杆菌（O139: K12: H）107/86 及124/76的生物学特性时发现的。该菌毛是蛋白质，具有良好的抗原性，在感染猪体内能吸附于肠上皮细胞刷状缘，但是很少引起肠上皮细胞的形态学变化。F107菌毛不凝集包括豚鼠在内的多种动物的红细胞，该菌毛在体外培养时，于普通营养琼脂培养基上不表达或表达很差，且其吸附作用不被甘露糖抑制，但在绵羊血平板上，于37℃培养时，能产生许多直径约4.6nm柔软长丝状无血凝性菌毛，而18℃不表达菌毛，另外还有一些菌株在体外无论是37℃还是18℃均不表达菌毛，但在动物体内却能正常表达。Rippinger P等根据F18的抗原性，将其分为两个抗原变种，因为该类黏附素都具有相同的抗原决定簇a，又分别具有特异性抗原因子b和c，故将两个亚型命名为F18ab和F18ac，F18ab菌毛与仔猪水肿病有关，而F18ac菌毛与断奶仔猪腹泻有关。
F18ab菌毛的编码基因位于大肠杆菌的基因组中，现已知编码F18ab菌毛的基因包括：fedA、fedB、fedC、fedE及fedF。fedA是编码F18ab菌毛主要结构蛋白的基因，基因序列长513bp，编码170个氨基酸的开放阅读框（ORF），其中前63bp为FedA信号肽编码序列，不包括信号肽在内的F18ab菌毛主要亚单位分子量约为15.009Ku；fedB、fedC都有一个分泌跨膜蛋白的前导信号肽和一个位于第23、24位氨基酸间的信号肽酶切割位点，编码F18的推进蛋白（FedB）和伴侣蛋白（FedC），蛋白分子量分别为86.00lKu和23.418Ku，与F18菌毛的合成、装配、成熟相关；fedE和fedF基因位于fedA基因的下游，编码次要亚单位，蛋白分子量分别为15.9Ku和30.3Ku。经实验表明FedE和FedF与菌毛的黏附功能和长度有关。Smeds A等（2003）通过点突变进一步研究表明，FedF蛋白位于第60位至第109位氨基酸区域，是F18菌毛结合到猪空肠上皮细胞受体所必不可少的，此区域第72位的Lys、第88位His和第89位His氨基酸残基，对于高效受体结合是非常重要的。Semds等和Tiels等一致认为FedF可以作为抗F18大肠杆菌的亚单位疫苗候选蛋白。
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