反向遗传系统在TGEV研究中的应用
顾江萍 上海交通大学
冠状病毒转录主要来自于畜牧研究人员对DI-RNAs的研究，包括TGEV包装信号的定位、S基因在TGEV中发挥的作用等，但是利用DI-RNAs得到的病毒基本生命过程的研究结果不一定总是使用病毒全长基因组，例如病毒的复制酶结构功能分析研究存在矛盾之处。用全长感染性构建物拯救出病毒来研究病毒的复制表达调控机制会更符合病毒的生命过程。这表明TGEV感染性构建物的研究在TGEV生物学研究和致病性机制探索的方面越来越实用。
感染性克隆技术为从分子水平上研究冠状病毒基因的结构和功能，病毒的致病机理提供了技术支持，也为开发嵌合疫苗、减毒疫苗、基因亚单位疫苗以及改造病毒基因组，构建新型病毒载体奠定了基础。冠状病毒基因组较大，构建全长克隆必须用大容量的载体，加之cDNA克隆在菌体内的不稳定性使构建基因组全长cDNA克隆十分困难。所以有些研究避开这两方面的问题，只以能够获得病毒感染性RNA为最终目的，即先利用RT-PCR技术扩增出覆盖基因组全长的几个cDNA片段，然后利用引入的定向插入位点将其进行体外连接获得基因组全长cDNA后，直接转录获得病毒RNA或者先构建出亚克隆，再在体外将其拼接成全长cDNA分子，直接进行转录获得感染性转录体。借助感染性克隆在体外对病毒的基因组进行基因敲除、定点诱变等人工操作，可深入了解病毒生命过程中各种基因的调控作用，进一步研究冠状病毒的致病分子机理。以感染性克隆为工具通过基因缺失、基因置换等手段还可以有效地确定病毒的关键毒力位点，从而为开发减毒疫苗提供理论支持。也可以利用基因嵌合技术将不同病毒保护性抗原基因进行嵌合，为多价疫苗的研制奠定理论基础。
设计抗病毒药物干扰冠状病毒复制是一个合理的方法，这需要在分子水平详细研究其复制机制，冠状病毒来源的复制子是选择有效干扰因子的有用工具，TGEV的复制机制的揭密必然会带动包括SRAS病毒在内的一系列冠状病毒的研究。Almazan等在以BAC为载体的TGEV感染性cDNA克隆的基础上构建TGEV基因缺失复制子，结果在缺失N基因的复制子转染的细胞中检测不到转录,说明N蛋白在复制活性中的可能角色。以上对基因进行缺失的手段推动了病毒致弱的分子机制的研究，提供产生减毒重组TGEV的有效方法。Ortego等通过反向遗传技术研究了E基因的功能，他们构建了缺失E基因的重组TGEV(rTGEV-ΔE)，该缺失突变体只能在表达E蛋白的细胞中生长，电镜显示rTGEV-ΔE感染BHK-pAPN-E-cells后，只有不成熟的细胞内病毒粒子组装。
这些病毒粒子没有感染性，不能分泌到细胞外的培养液中。RNA和蛋白组成分析显示rTGEV-ΔE病毒粒子含有RNA和除E蛋白以外的TGEV所有蛋白，共聚焦和免疫电镜显示由于缺乏E蛋白，病毒在分泌途径中的中间运输过程和完整病毒的成熟过程被阻止。Galan等用TGEV全长和2个TGEV来源的微基因组开展病毒拯救进行TGEV基因组的637位碱基(位于ORF1a内)的位点突变分析，发现两者拯救病毒需要不同的核苷酸。位点突变导致的不同病毒拯救效率提示两种拯救方式病毒的复制机制的差异，也进一步说明用全长cDNA克隆研究病毒复制机制的必要。另外，冠状病毒作为分子克隆的表达载体有几个比其他病毒病毒载体优越的地方：
①单股RNA病毒在细胞浆内复制，没有DNA中间体存在，因而不可能整合到宿主细胞染色体中去。
②这些病毒基因组大，从理论上讲可以容纳较大的外源基因。
③冠状病毒一般感染黏膜表面,呼吸道和肠，能诱导产生强烈的黏膜免疫反应。
④冠状病毒的组织嗜性可能通过改变S蛋白基因而改变。
⑤存在感染许多种属动物(人、猪、犬、猫)的非病原性的冠状病毒株，可用于开发不同表达系统。
⑥已建立感染性的DNA克隆，可用于表达载体构建。
⑦多顺反子基因组结构和sgmRNAs的合成可能允许多个外源基因的同时表达。
⑧与动脉炎病毒表达载体相反,冠状病毒基因间序列很少与上游ORFs重叠，使表达外源基因方便。
⑨TGEV下游的几个ORFs能从病毒基因组去掉而不会影响病毒体外感染性。
SolaI等将BAC作载体的TGEV感染性cDNA克隆改造成一个表达载体，此载体可在ORF3处插入外源基因，0.72kb的绿荧光蛋白GFP基因通过取代非必需的3a和3b基因而克隆RNA基因组(保留ORF3a的TRS)，异源荧光蛋白可稳定、高效地表达，且人工载体的表达水平同其他载体的表达水平一样高。虽然含有GFP的重组TGEV对肠道仍有致病作用，但其在肠组织中的生长速度降低了10倍～100倍。
其可诱导产生针对TGEV和GFP诱导特异性的乳源免疫反应,母猪及其所产仔猪对异源蛋白有特异性促乳免疫反应，对仔猪提供黏膜感染的保护作用，这均显示出TGEV感染性克隆作为黏膜免疫疫苗载体的潜力，因而TGEV将作为一种活病毒载体在猪病的预防中发挥重要作用。
但作为载体还要考虑安全问题，Curtis等在TGEV感染性构建物的基础上，构建了缺乏ORF3b、E或ORF3b、E、M基因的复制子(复制子分别命名为TGEVRep(AvrⅡ、TGEVRep(EcoNⅠ)），因为E和M蛋白是TGEV出芽所必需，所以这些RNAs复制子应能复制但不能导致感染性病毒的产生。为准备能组装TGEV复制粒子(TGEVVRP)的包装系统,将TGEVE基因克隆进委内瑞拉马脑炎(VEE)复制子表达载体中,分离编码TGEVE基因的VEE复制粒子。将TGEVRep(AvrⅡ)与VEE-TGEV(E)RNA转录子共转染BHK细胞，或在TGEVRep(AvrⅡ)转染后，再感染携带TGEVE基因的VEE病毒复制粒子(VRPs)，2种情况下都能在感染细胞中检测到GFP的表达和转录子。由于缺乏子代病毒释放，另外在TGEV复制子包装系统中涉及一个不相关载体的运用，使复制子和辅助RNAs间的重组事件发生的可能性减少,所以该表达系统比减毒活疫苗安全。
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