TGEV反向遗传系统的建立
顾江萍 上海交通大学
全长cDNA感染性克隆技术也称反向遗传学技术，它是指兽医由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术，包括病毒基因组全长cDNA克隆构建技术和由质粒DNA转录病毒RNA的感染性转录体制备技术。冠状病毒是已知RNA病毒中基因组最大的一类病毒，其基因组复制不涉及DNA中间体，所以要进行病毒分子水平上的研究，必须将病毒基因组RNA转换成cDNA，然后构建出cDNA克隆，通过对cDNA克隆的操作间接实现对病毒基因组RNA的操作，从而为冠状病毒基因组研究提供易于操作的技术平台，大大提高了病毒的研究潜力。冠状病毒基因组片段太大，同时cDNA克隆在宿主细胞不稳定等因素一直制约着冠状病毒全长基因组反向遗传系统的建立。
近年来，冠状病毒的反向遗传技术有了突破，国外已成功构建出数种冠状病毒全长cDNA克隆，对TGEV已有数篇报道。其原理是在获得冠状病毒基因组全长cDNA后，通过体内或体外转录系统获得感染性转录本，转染细胞后产生有感染性的病毒粒子。通过对病毒基因修饰后拯救出的病毒与野生型病毒表型的比较，可用来研究病毒在生命周期中病毒特性和致病机理,也对寻找新型疫苗进行病毒病的防治和基因治疗等方面提供理论支持。而国内对反向遗传研究相对起步较晚，尤其是TGEV感染性克隆，有部分初步研究探索的文章，但尚未见成功构建的研究报道。
Almazan等在构建猪传染性胃肠炎病毒全长cDNA时，用该病毒的一株缺陷RNA毒株(DIC)。此缺陷毒株基因组大小为9.7kb，它在低拷贝和高拷贝质粒载体中都可稳定存在，DICRNA相对TGEV完整基因组有三个缺失序列，分别位于基因组的ORF1a、ORFlb和结构基因中。他们将这三个缺失用TGEVPUR—MAD株的基因序列按一定先后顺序填补完整，然后将全长cDNA分子克隆到细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)中，用2步扩增系统，转染进ST细胞的cDNA首先在cDNA克隆自带的CMVIE启动子下在细胞核内被细胞RNApolⅡ所转录，第2步扩增在胞浆内为病毒多聚酶所驱动。这样得到的PUR-MAD株全长cDNA克隆保留了引入的所有遗传标记，合成的病毒具有预期的抗原特性。
系统性体外装配是组建TGEV全长感染性构建物的又一方法。利用一些独特的限制性内切酶位点作为各段cDNA克隆的接头，这些接头序列是基因组本身携带或通过在PCR引物中进行沉默突变而巧妙引入，使得毗邻cDNA亚克隆间精确组装，病毒基因对细菌毒性问题通过对该区分段克隆也得以解决，导致TGEV全长cDNA产生，体外转录是有感染性的，其空斑纯化病毒与野生型TGEV具相同的空斑形态及生长动力学规律。
Youn等尝试分段克隆，利用亚克隆体外连接与直接转录的方法产生RNA，用RNA转染细胞拯救病毒，其优点是简便、直接，避免了不稳定克隆的出现，他们还发现共转染表达TGEV-N基因的质粒可提高TGEV的感染力，说明N基因有反式激活作用，该方法设计主要是利用一些特殊的限制性内切酶作为各个cDNA克隆的接头，这些接头序列可通过诱变PCR方法进行沉默突变而巧妙地引入，又不影响病毒本身编码序列。这种系统性体外装配方法可进一步运用到微生物(如细菌、真菌)全长基因组甚至高等生物基因组的合成。然而，这种方法虽然操作步骤简单，但难度很大，主要表现之一就是基因组亚克隆片断的体外拼接。
上一篇： 猪传染性肠胃炎病毒的变异性
下一篇： "以养为主"成气候 ——广西钦州渔业养殖跨越发展纪实
