猪传染性肠胃炎的分子生物学诊断方法
顾江萍 上海交通大学
1RT-PCR
Woods等建立了TGEV的RT-PCR检测技术,结果证实RT-PCR是一种特异、敏感的诊断方法。国内李军等建立了检测TGEV的RT-PCR方法，用此RT-PCR方法检测56份猪腹泻粪样,同时用夹心ELISA法作对照。结果显示,RT-PCR法检测的20份阳性粪样，用夹心ELISA法检测有14份呈阳性两者的符合率为89%。试验结果表明，RT-PCR法可检出lpg的TGEVRNA，比夹心ELISA法敏感性更高,说明RT-PCR方法可用于TGEV的诊断和流行病学调查。PatonD和IbataG改进了RT-PCR，用来扩增TGEV和PRCVS基因5'端序列，区分二者是通过PCR产物的片段大小,该实验检测了26种TGEV和PRCV分离株病毒核酸的RNA。根据PCR产物的电泳结果与预测的核酸分子量大小相比较,可以判定样品中是否有TGEV的存在。这种方法较较之已知的传统的血清学和免疫学方法的优势在于可以免去病毒分离过程,快速准确，有较高的特异性和敏感性。
2多重RT-PCR
多重PCR法是采用多对引物,在一个反应中扩增多种靶序列。多重PCR鉴定的优点是可以快速的鉴别诊断两种以上的病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，而且避免了逐一分离每个待测样品中病毒的麻烦。KimO和ChoiC用改进的多重RT-PCR方法来区分PEDV和TGEV，以半数致死量的TGEV和PEDV经人工感染3日龄仔猪后取病变组织，提取病毒RNA，以此为模板,以TGEV和PEDV的两对基因引物进行扩增,根据RT-PCR的产物片段大小与预测DNA片段大小相比较。该方法的难点在引物设计上，要求引物具有特异性。另外引物设计的越多，发生引物二聚体的几率就越大，还可造成与模板非特异性的结合，影响PCR反应的进行。多重RT-PCR方法多用来在一种组织中同时鉴别多种病毒，但这种方法一般适用于一种核酸类型的病毒。
3套式RT-PCR
套式RT-PCR方法专门应用于鉴别TGEV和PRCV，因PRCV在S基因5'区上有一个比较大的缺失区，在基因3'3a和基因3'3b上有一个小的缺失区，缺失区的大小因分离株的不同而有所差别，如PRCV的Europe和US株。PRCV具有呼吸道组织嗜性，温和的亚临床呼吸道感染状态，传统检测抗原的诊断方法不能区分二者，阻断ELISA方法也只是在疾病发生一段时间后进行。KimL和ChangKO建立了一种将套式PCR与RT-PCR相结合的方法，该法是针对二者S基因部分序列的差异性而设计出来的。反转录体系引物是针对于PRCV的S基因缺失区而设计，上游引物和下游引物恰好位于PRCVS基因缺失区两端。这样对样品进行RT-PCR反应结果是：如果有TGEV的存在，那么产物应为阳性，在电泳的泳道上可观察到与预先设计一样大小的DNA片段；反之，则为阴性。
4核酸探针杂交技术
核酸探针是将特定标记物通过随机引物法、PCR法、缺口平移法等标记到某段特定的核苷酸上，与待检核酸样品在一定的支持物上进行杂交，然后通过一定显示系统来探查靶核酸的一种特异性检测方法。目前，己建立了用核酸探针杂交技术检测粪便样品、感染组织或感染细胞中的TGEV，用这些探针可区别不同TGEV毒株。
5放射性探针膜杂交
TGEV为单股正链RNA病毒，根据将病毒RNA反转录而来的一段cDNA用放射性同位素标记后与病毒的mRNA可发生特异性结合的原理，ShockleyLJ和KapkePA首先克隆长为2000个碱基的cDNA探针来诊断TGEV。而后Benfield和Jackwood建立了用核酸探针检测细胞培养物和样品中TGEV的斑点杂交(DotBlot)法。他们应用放射性同位素32P对五种不同的cDNA探针进行标记这五个探针分别是位于TGEV核酸S基因5'端的HP1600、PD24、PE21和位于3'端非编码序列的PA2、PB4。其中5'端的探针PD24可以用来区分冠状病毒属的不同成员，如CCV、FIPV、PRCV，最小检出量为20~200ng。
6放射性标记探针原位杂交
1996年SirinarumitrT和PaulPS使用了含有TGEVS基因部分序列的两种质粒，分别为pPSP.FP1和pPSP.FP2，将其制备成放射性35SRNA探针分别检测了接种于细胞培养物上和自然感染病变肺脏组织中的TGEV和PRCV。发现TGEV的RNA主要存在于肠道上皮绒毛顶部,较少一部分存在于隐窝上皮细胞中，而PRCV主要在呼吸道上皮细胞中复制，较少一部分在型肺泡细胞型肺泡细胞和肺泡巨噬细胞中增殖，这项研究证明原位杂交在区分组织中的TGEV和PRCV时具有潜在的应用价值。尽管原位杂交是一种比较有效的检测工具，但却存在着费时的弊端。
7非放射性探针原位杂交
放射性同位素标记的核酸探针优点是灵敏性极高、杂交的结果很干净、清晰。但对环境污染和对实验操作人员具有强烈的伤害，限制了它在临床实践中的应用。近年来，非放射性标记物如荧光素、生物素、地高辛等标记的核酸探针被广泛的应用到TGEV分子生物学的研究中，其中对地高辛标记的TGEV核酸探针研究得更为广泛和深入。这种检测技术具有特异性、准确可靠、速度快、安全、对环境及人体无害等优点，其标记物可反复使用不存在半衰期的问题。其标记的核酸探针在50%甘油于-20℃可保存半年之久,被广泛用于基因定位、诊断、序列分析、核酸的转移、克隆。2001年KimB和ChaeC采用了非放射性地高辛标记的cDNA探针与TGEV的核衣壳蛋白基因进行杂交，并与传统的病毒分离(IV)、荧光抗体实验(FAT)、扫描电镜(TEM)等方法作了比较,探针的检出率最高为81%。该法与传统的VI、FAT、TEM相比其特异性较高，而且不用分离病毒可快速进行组织学诊断TGEV。原位组织杂交技术不但可检测到TGEV同时还可提供被感染细胞的信息，TGEV主要存在于成熟的有吸收性的肠上皮细胞组织中，而隐窝的上皮细胞中也发现了TGEV，但是量少。
综上所述，近年来兽医诊断TGEV的诊断技术进展显著，尤其是分子生物学技术的应用为诊断TGEV提供了强有力的手段，成为今后诊断技术的发展方向。同时传统诊断方法如病毒分离和鉴定、电镜技术等，其诊断价值不能忽略。在实际工作中,我们只有将传统的诊断方法与新型的分子生物学诊断方法结合起来，取长补短，才能取得满意的效果。
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