溶菌酶释放蛋白和胞外因子的免疫作用
张静 上海交通大学
溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein, MRP）又称类M蛋白，由1256个氨基酸组成，大小为136kDa。MRP存在于细胞表面，与SS2的粘附作用有关，是SS2的一种重要的毒力因子，具有良好的免疫原性，是良好的保护性抗原，可作为亚单位疫苗候选蛋白。MRP完整基因在大肠杆菌表达系统中的表达量相当低，可能与高水平表达MRP对宿主菌有毒性作用有关。
1989年Signas C等畜牧研究人员对MRP的619至985位氨基酸的片段进行克隆表达，发现与金黄色葡萄球菌的纤维素结合蛋白的功能很相似。2002年国内欧瑜等首次克隆表达了SS2江苏分离株HA9801mrp基因750-1634bp的片段，免疫印迹分析，表达蛋白表面有MRP抗体结合表位。2004年范红结等克隆了SS2 HA9801株mrp基因的298-827bp间529bp片段，表达大小为42kDa的重组蛋白，表达蛋白经QIAgen镍亲和层析柱层析纯化，以含20ug、40ug、80ug纯化蛋白的剂量分组混合弗氏完全佐剂首免和不完全佐剂二免后，以5LD50SS2-D菌株攻击，BALB/c小鼠的相对存活率分别达到62.5%、62.5%、50%，表明所表达的蛋白具有保护性抗原的功能，提示该片段可能为MRP重要的功能区。
2008年李耿等利用表达载体pGEX-3X表达了MRP的功能性片段，大小为73kDa的重组蛋白经谷胱甘肽亲和层析纯化，以50 ug纯化蛋白免疫BALB/c小鼠，首次免疫加等量弗氏完全佐剂，2周后加等量弗氏不完全佐剂进行第2次免疫，10d后以5LD50SS2 CVCC606攻击BALB/c小鼠，可产生60%的免疫保护率，生理盐水对照组小鼠则全部死亡。
SS2胞外因子(Extracellular protein facter, EF)的分子量为110kDa，仅能从培养物上清液中检出，为细胞外蛋白，是SS2的一种重要的毒力因子。对EF的epf基因序列进行分析，发现其存在三个开放阅读框。根据对从荷兰分离到的180株SS2菌株的MRP与EF分析发现，从病猪体内分离的菌株有80%为MRP+EF+表现型，从健康猪扁桃体中分离的菌株该表现型占2%，86%表现为MRP－EF。
2001年WisselinkHJ等对SS2毒力因子MRP及EF这两种的免疫保护作用进行了研究，发现以亲和层析法提纯的MRP或EF单独免疫猪，对的保护率低于将两种提纯蛋白混合免疫组及MRP和EF阳性的菌株全菌灭活疫苗组，但临床症状比对照组显著减轻，研究还发现，采用油包水(a water-in-oil emulsion, W/O)的效果优于铝胶(aluminiumhydroxide-based adjuvant, AH)，前者可以提高抗体滴度。2003年欧瑜扩增SS2HA98011207-1675bp序列，表达的42 kDa融合蛋白不能被EF抗血清识别，表明抗原表位不在该区。2005年李明等扩增了猪链球菌2型江苏分离株SS2-1 epf基因1783-2563位，连接pET-32a表达大小为47kD的蛋白，免疫转印结果发现该蛋白可与其抗血清发生作用，表达蛋白具有免疫原性，显示该片段为EF的主要功能区。同时研究表达蛋白EF对新西兰兔的免疫保护率，免疫5只新西兰兔，最小致死量SS2-1攻击，5只兔全部死亡，MRP免疫组1/4获得保护，SS2-1全菌灭活苗组获得100%保护。
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