慢病毒载体简介
曹齐树 华中农业大学
近几年来，慢病毒载体逐渐发展成熟，己成为畜牧研究中表达载体的主导，主要是因为其具有独特的优势。慢病毒载体与其它表达载体相比，最大的优势是它们能感染分裂和非分裂的细胞，能够解决转染效率低的问题;另外慢病毒载体可以使得所携带的目的基因在宿主细胞中得到长期稳定的表达;还有就是经过改造的慢病毒载体可以容纳约10kb大片段外源基因，并且可以有多个转录启动子。慢病毒载体的这些优点使其成为了体内和体外基因转移乃至转基因动物研究的一种有效工具。
1 慢病毒载体基本结构
慢病毒(Lentivirus)属逆转录病毒科(Retrovidae)，是RNA病毒。慢病毒载体以HIV-1型最为常用，还有HIV-2型载体系统，猿类免疫缺陷病毒(sIV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)等。
HIV-1型慢病毒载体的构建过程主要是去除野生型病毒基因组中的致病基因和3’端LTR中的全部U3序列，使得LTR区的转录激活能力下降，形成了自我灭活型载体系统。这个系统去除了致病基因，保证了载体的生物安全性。复制缺陷型HIV载体通过水泡口炎病毒(vesicular stomatitisvirus)G糖蛋白(VSv-G)来替代扭v-l型载体中的包膜蛋白进行包装。不仅使其更安全，宿主范围更广，而且还能增加病毒的滴度。
将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中，然后将这两个质粒与基因组质粒共转染293FT细胞就可以产生重组慢病毒。慢病毒载体系统主要是由三种不同质粒构成，分别是转移质粒，辅助质粒和包膜表达质粒。转移质粒主要是用来插入外源目的基因，同时也保留了对病毒的整合复制起主要作用的元件。辅助质粒主要包括gag、pol和rev蛋白，gag主要是编码病毒的核心蛋白，pol则主要编码病毒复制过程中所需要的酶，而rev蛋白则参与编码班V结构蛋白m丑NA的核一浆转运过程。
慢病毒载体的发展经历了三个阶段，每个阶段的改造均是为了考虑载体的生物安全性，目前常用的有载体是由Invitrogen和Clontech两个公司生产的。生物安全性更高的是四质粒系统:插入目的基因的pLenti表达载体;表达慢病毒结构所必需的gag基因以及病毒复制和整合必需的pol的pLPI质粒;表达Rev蛋白的pLPZ质粒水泡炎病毒G糖蛋白(VSV-G)，让宿主范围更广。这四个质粒共同作用才能够产生有感染力的病毒粒子。
2 慢病毒载体的应用
慢病毒载体技术在转基因动物的研究上起到了重要的作用，目前转基因小鼠、大鼠以及转基因猪都有报道。转基因猪的成功制备对目前医学上供体器官的短缺提供了可持续的帮助。另外，相关的实验也证实了慢病毒载体在癌症的治疗和抗HIV等疾病方面都有一定效果。可以将慢病毒载体技术结合RNAI技术用于基因治疗，并且还可以研究细胞中特定基因的功能，这是功能基因组研究领域的又一大突破。改造载体系统中的包膜质粒可以研究包膜蛋白的功能及其与宿主细胞的互作，这在冠状病毒等研究上已有报道。另外已有研究成功构建了JEVE基因的假病毒，且目前假病毒的研究也有很多报道，这对本实验在理论和技术上有一定的指导性帮助。
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