猪传染性胃肠炎病毒的分子学诊断
肖文 华中农业大学
1核酸探针杂交技术
核酸探针是通过PCR扩增法、随机引物法或缺口平移等方法将特定的标记物标记至某特定的核普酸序列上，然后与核酸样品进行杂交，通过显示系统来检测把序列。TGEV的放射性探针杂交法是利用放射性同位素标记的一段反转后的cDNA与病毒的n1RNA进行特异性结合的原理。Benfield等建立了核酸探针来检测TGEV的斑点杂交(DotBlot)法。结果与电子显微镜检测以及免疫荧光试验的结果相似性很高，由此证明放射性探针杂交法具有很高的灵敏性以及特异性。但由于放射性物质对人，对环境都具有很大的伤害，因此，近年来利用非放射性标记物来标记核酸探针，且已被广泛的应用到兽医研究中。但非放射性探针同样具有不足之处，它的灵敏性以及特异性等都不如放射性标记物标记的探针。
2免疫胶体金标记技术
胶体金是由氯金酸(HAuC14)在还原剂(如构椽酸钠，鞭酸等)的作用下，聚合成特定大小(1一150nm)的金颗粒，然后由于相互静电作用形成稳定的胶体状态。免疫胶体金技术则是以该胶体金做为一个示踪物质，将其应用于抗原抗体的一种新型标记技术。由于胶体金在相对弱碱环境中带负电荷，而其他许多大分子物质如蛋白质等带正电荷，因此胶体金与大分子物质牢固结合，并且由于是静电结合，所以也不影响生物大分子特性，从而使它成为免疫反应中很好的标记物，因此广泛应用于免疫学，组织病理学等生物学领域。
3 PCR技术
PCR法是目前实验室最常用的一种检测方法，能够检测出样本中微量的核酸，具有多种优点。对于TGEv，包含有RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR等。对于TGEV，RT-PCR是一种特异强且敏感性高的诊断方法，英国P歌on以及李军等用建立的RT-PCR方法与夹心ELISA法作对比，结果表明RT-PCR法敏感性更高。该方法具有操作性简便，适用于大批量的临床样本检验，该方法对于TGEv的检测诊断以及流行病学的调查中具有重要意义。
套式RT-PCR原理是针对DNA模版设计两对特异性的引物，外引物和内引物，首先以外引物扩增目的片段，然后以该扩增产物为模版，利用内引物再次扩增，从而提高扩增效率。该方法的敏感性比普通RT-PCR更强。
多重RT-PCR是指在同一反应体系中加入2对及以上的引物，针对不同的引物，能够同时扩增出不同的核酸片段的Rl飞PCR反应。该方法能够同时检测多种病原微生物具有高效性而且更加的经济简便性，同时也具有普通Rl-PCR的高敏感性等多种特点。KimO于2000年运用多重RT-PCR方法对腹泻的断奶前仔猪进行PEDV和TGEv的检测，表明该方法能直接检测粪便或者肠道组织样本。2010年，张坤建立了一种能够同时检测PEDV、TGEV、GAR三种引起腹泻的病毒的多重RT-PcR。但这种方法一般只适用于一种核酸类型的病毒。
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