猪葡萄球菌的脱落毒素分析
张乐宜 内蒙古农业大学
葡萄球菌产生的脱落毒素可以引起人和动物发生严重的皮肤性疾病。例如金黄色葡萄球菌可引起人的烫伤样皮肤综合症，猪葡萄球菌可引起仔猪发生渗出性皮炎。目前发现的脱落毒素有 8 种，包括金黄色葡萄球菌产生的 ETA、ETB 和 ETD，以及猪葡萄球菌产生的 EXHA、EXHB、EXHC 和 EXHD、SHETA、SHETB。
表皮脱落毒素是猪渗出性皮炎致病机理中的关键因素。脱落毒素是一种细胞外蛋白质，分子量大约 30KD ，由丹麦研究者发现的脱落毒素分为 4 种类型分别命名为ExhA、ExhB 和 ExhC，还有一种在抗原性与上述蛋白有显著不同的脱落毒素被称为ExhD。在日本 HISAAKI SATO 等(1999)发现并纯化的脱落毒素(Staphylococcushyicus Exfoliative Toxin, SHET)有 2 种类型，分别命名为 SHETA 和 SHETB。
Peter Ahrens等人对S.hyicus中编码脱落毒素ExhA、ExhB、ExhC和ExhD的基因分别进行了克隆和测序。他们发现编码这四种脱落毒素的基因从816bp到834bp不等。四种脱落毒素的氨基酸序列也与先前报导的猪葡萄球菌的SHETB和金黄色葡萄球菌的ETA、ETB 和ETD具有同源性。猪葡萄球菌与金黄色葡萄球菌处于同一水平的同源性。ExhA、ExhB和ExhC在丝氨酸酶催化位点的保守性上具有相似性，但是在EXHD中，推定的催化位点上由Glu替代了原来的Asp。另外，这些脱落毒素可以在大肠杆菌中进行重组表达，其中3/4的毒素可以与利用脱落毒素制备的单克隆抗体结合。
Lars Ole Andresen ，丹麦兽医实验室，从1997年8月到1998年5月利用建立的间接ELISA对69个猪场的655头猪进行了调查。每个猪场的发病率为74%，同时实验表明从猪群体中分离到的猪葡萄球菌菌株99%含有毒素基因。其中含毒素的为51株，不含毒素的菌株为18株(26%)。他们发现在含有毒素基因的EXHA、EXHB的培养液中加入二价的锌离子盐和钴离子盐类能提高对含有这两种毒素的菌株的检出率。单独加入锌离子能提高含有EXHC毒素基因的菌株。其结果显示加入二价金属离子的培养基所产生的脱落毒素量要比未加入金属离子的高出很多；而当在含有二价金属离子的培养基中加入金属离子螯合物时，脱落毒素的产量大幅减少。上述实验结果说明脱落毒素ExhA和ExhB的产生是金属依赖性。另外，研究发现通过免疫印迹试验也可以对不同毒株产生的毒素进行鉴别。
Y Fudaba 等人发现猪葡萄球菌脱落毒素能够选择性消化 Desmoglein(Dsg)。在实验中，他们对所有的脱落毒素，包括：ExhA、ExhB、ExhC、ExhD 以及金黄色葡萄球菌产生的 ETA 和 ETB 进行了克隆和表达，并将 ExhA、ExhB、ExhC、ExhD 分别注入猪体内后，能够引起猪表皮出现水疱和结痂。动物体的表皮细胞表面通常被Desmoglein-1 覆盖，而不是 Desmoglein-3，当正常的猪表皮细胞被脱落毒素感染的时候 Desmoglein-1 被完全消化。纯化的毒素蛋白在仔猪皮肤上可以引起与 EE 相类似的病变，纯化毒素的作用是使表皮中细胞分离，特别是使上部的棘细胞层中的细胞分离，从而使细菌在表皮中迅速扩散，皮肤脱落并伴有大量皮脂分泌物和浆液分泌物。
Wegener HC在丹麦，对从患有渗出性皮炎的仔猪身上分离到的猪葡萄球菌进行了研究，结果发现这些菌株含有不同的噬菌体类型、质粒图谱、抗生素的耐药模式。用这些含有毒素的菌株注射仔猪进行试验时将其进行了分型，大致分为能产生渗出性皮炎的带毒株和皮肤真皮层不发生改变的无毒株。并且发现带毒株和无毒株同时存在于发病猪，这给诊断该病带来了很大的困难。用9株带毒菌株培养的浓缩上清液给健康仔猪进行皮下注射，所有实验组的仔猪都出现蜕皮症状。通过组织病理学方法观察和检测，发现皮肤的外壳发现棘皮层增厚。用9株无毒株培养浓缩的上清液组的仔猪的皮肤无眼观变化或微观变化。
目前，所有能引起皮肤发生病变的浓缩上清液中毒素蛋白的分子量大约为30KD。在不能检测到样品中未发生皮肤变化时，没有发现其他蛋白具有类似协同作用。总之，临床上可以通过有结痂反应的仔猪作为判定带毒株引起的仔猪渗出性皮炎的合适指标，带毒株的猪葡萄球菌产生毒素蛋白的分子量大小约30KD。而无毒株菌株培养的上清液中则不含有该毒素蛋白。
Tanabe T在日本从健康猪和发生猪渗出性皮炎的猪群中分离了猪葡萄球菌，其中从8个感染猪渗出性皮炎的猪场分离到了37株猪葡萄球菌，从两个健康的保育猪场分离到131株猪葡萄球菌。从感染渗出性皮炎的猪群中分离猪葡萄球菌比率为100%，健康猪群为35.4%。同时，对分离到的菌株进行分离培养和生化鉴定。他们用培养液的上清感染 1 日龄小鸡后出现皮炎症状。而且分离到的大多数菌株都产生 SHET 脱落毒素，其中从感染的猪群中分离到的菌株产生 SHET 毒素的比例为87.5%；从健康猪群中分离到的菌株产生 SHET 脱落毒素的比例为 76.1%。他们通过免疫琼脂扩散试验，将 SHET 脱落毒素分为两个血清型。并利用产生毒素和不产生毒素的菌株进行动物实验，不产生毒素的菌株皮下注射 48h 观察结果，另外一组皮下注射产生毒素的菌株 7 日后观察结果。结果发现注射产生毒素菌株培养液的仔猪出现典型的临床症状，皮炎，蜕皮，结痂。而不产生毒素的菌株无任何临床症状。
Hisaaki Sato证明了金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌产生的两种脱落毒素蛋白分子受染色体和质粒控制 ，并根据其血清学将这些毒素的种类一一命名。同时根据分子量大小又将其分为不含质粒的 SHETA(P-1)菌株和含有质粒的(P-10，P-23)SHETB 菌株，SHETA 血清型可以使 1 日龄的小鸡表皮脱落，猪葡萄球菌的 P-23plasmid-cured 的亚系(P-23C1 和 P-23C2)能使 1 日龄的小鸡发生表皮脱落，而 P-10 亚系(P-10C1 和 P-10C2)能够使 1 日龄的小鸡发生表皮脱落，但是，他们都能降低剥落能力的活性。研究还发现，P-10 菌株除分泌合成 SHETA 以外还分泌合成 SHETB，而 P-23 菌株仅分泌合成 SHETB。携带质粒的菌株(P-23)和不携带质粒的菌株(P-1)引起仔猪发生渗出性皮炎在临床上出现的症状是一样的。而 P-23 菌株的 plasmid-cured亚系引起的猪渗出性皮炎在临床上无任何典型的征兆。另外发现 SHETA 的分泌合成受染色体的控制，而 SHETB 的分泌受质粒的控制，因此，将产生 SHET 脱落毒素的菌株分为 3 类：SHETA-producing strains，SHETB-producing strains，strains producingboth toxins。Amtsberg 研究表明猪葡萄球菌的培养物能产生一种外毒素，能够引起仔猪渗出性皮炎。这种外毒素的剥落活性与金黄色葡萄球菌产生 ETS 脱落毒素很相似。
Talah Kanbar对在俄罗斯流行的23株、德国的17株菌株中对含有毒素SHETA、SHETB的菌株利用PCR技术进行了鉴定。其中检测到16株含有毒素SHETA。另外SHETA阳性的毒株同时也能检测到EXHD和EXHC脱落毒素的编码基因。
杨彩娟等对EXHB全基因进行了测序，证明了本实验室分离到的菌株与国外分离到的菌株同源性达97.4%，并对构建的重组载体进行了诱导纯化，获得了一条45KD大小的目的蛋白片段，他们发现EXHB基因的免疫原性明显优于其他三种基因。同时对裸鼠进行了致病性试验研究，结果表明EXHB基因对预防猪渗出性皮炎起着极其重要的作用。张曦，杨鼎等从EXHB基因的N端和C端重新设计引物进行PCR扩增，构建重组载体获得了一条大约30.7KD大小的蛋白目的片段，他们通过ELISA实验证实N端基因分泌的蛋白免疫原性优于C端基因分泌的目的蛋白。
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