基因打靶技术在猪上的应用和发展
张翼 中国科学技术大学
基因打靶技术在现如今已在畜牧养殖领域中得到广泛的应用，成功分离的完善的胚胎干细胞系和胚胎重建技术是该技术在小鼠上得以快速发展的重要基础。但是大多数的动物，尤其是大动物，例如猪，细胞在培养的过程中会逐渐地丧失其全能性，不能将遗传修饰传递给后代，这是建立猪稳定的胚胎干细胞系的重大障碍。在过去的五年中，构建了超过 14,000 为敲除小鼠上的基因的载体，而在猪上敲除的基因还不到 10 个。
1996 年利用胚胎成纤维细胞克隆成功获得绵羊,随后，Dolly 羊也成功诞生，说明已分化的细胞经过一次静息期可获得重编程的能力，这为在大动物上进行基因打靶提供了一个新的方向，即通过转基因克隆技术实现基因打靶。将基因敲除和体细胞克隆技术相结合可以弥补大动物中没有胚胎干细胞系的障碍，进行各种基因修饰。
2000 年世界上首次通过体细胞核移植成功诞生基因敲除的绵羊，之后的 2002 年，赖良学等用体细胞核移植的方法敲除了猪的α-1,3-半乳糖苷酶基因。他们在 GGTA1 位点上构建了一个长为 21kb 的置换型打靶载体，G418 筛选猪胎儿成纤维细胞 14 天后，用 2对引物检测 17 个克隆，其中有 8 个细胞克隆发生了同源重组。共移植 338 枚胚胎，得到 7 头小猪，3 头死亡，其余四头活力正常。这项成果使异种器官移植迈出了关键的第一步，同时也让科学家们看到在大动物上实现基因打靶的希望和曙光。
除了使用猪胎儿成纤维细胞作为转染的受体，人们也在寻找其他的细胞希望能够尽可能和胚胎干细胞相似。2011 年的 7 月份，报道了在猪的胎儿肝脏衍生细胞中进行基因打靶和克隆的研究。研究者发现胎儿肝脏衍生细胞可以分裂 80 代以上，依然保持正常的核型。
基因打靶和杂合性缺失突变产生纯合的 α-1,3-半乳糖苷酶的打靶细胞克隆。将这些阳性的胎儿肝脏衍生细胞克隆用于体细胞核移植能产生纯合的 α-1,3-半乳糖苷酶打靶猪。近年来锌指核酸酶（ZFNs）和体细胞核移植结合也运用到了猪的基因打靶中。锌指核酸酶是是人工改造的限制酶，通过融合锌指结构的结合 DNA 结构域和分解 DNA 结构域而成。可通过基因工程改造锌指结构域使锌指核酸酶针对复杂基因组里的特定 DNA 顺序。借助内源 DNA 的修复机制，锌指核酸酶可以精确改变高等动物的基因组。
人工构建的具有特异性的锌指核酸酶由两部分组成:一部分为可以特异性结合到 DNA 上的锌指蛋白,另一部分来自于限制性内切酶Fok I 的一个亚基,它能够非特异性地切割 DNA 双链,产生一个 DNA 双链切口。人工锌指核酸酶的锌指蛋白结构域一般含有 3 个锌指结构,每个锌指可特异识别并结合 DNA 链上的 3 个连续碱基。
所以 ZFN 与 DNA 的结合是高度特异的。2010 年，Jeffery 等运用锌指核酸酶和体细胞核移植相结合的方法，将转入猪体内的绿色荧光蛋白基因敲除，产生了外源基因打靶猪。2011 年，世界首例利用锌指核酸酶技术培育的内源性基因敲除猪诞生。
噻唑烷二酮类药物（例如文迪雅）是胰岛素增敏剂，用于治疗 2 型糖尿病，2006 年曾经是临床上销售额最大的治疗糖尿病的药物。PPARγ 是噻唑烷二酮类药物的靶点。科学家们利用小鼠的研究结果表明，噻唑烷二酮类药物在治疗糖尿病的同时对心血管系统也有保护作用，但由于小鼠心血管系统与人类相差甚远，使得小鼠的研究结果与近年临床上观察到的病人心脏毒副作用不一致。
因此，科学家们急需建立与人类更为接近的大动物模型来研究糖尿病及其心血管并发症。由于猪的心血管系统与人类接近，是理想的研究糖尿病和心血管疾病的动物模型。此次研究中，研究者将锌指核酸酶技术应用于猪体细胞的基因敲除，使体细胞基因敲除的效率由原来的10的-6次方提高到大于 4%，并结合克隆技术成功获得了 2 头 PPARγ 基因敲除猪，首次实现了该技术在大动物内源性基因敲除中的应用。同年的 9 月份，又报道运用此技术高效产生了 α-1,3-半乳糖苷酶（GGTA1）基因的双等位基因敲除猪。研究者针对编码 GGTA1 催化中心设计含有特异区域的锌指核酸酶，并用来处理猪胎儿的成纤维细胞，产生约 1%的双等位基因敲除细胞，体细胞核移植后，6 个胎儿全部缺失半乳糖的抗原表位。
基因敲除猪的应用主要用于建立疾病的转基因动物模型，改造动物基因型，发现和研究基因，研究发育生物学，治疗遗传病，免疫学方面的器官移植和人源化抗体的制备。本实验为了进行 Tiki1 基因的功能缺失研究，采用传统的置换型打靶载体以期敲除猪的 Tiki1 基因。
上一篇： 猪胚胎的早期发育
下一篇： "以养为主"成气候 ——广西钦州渔业养殖跨越发展纪实
