猪体细胞克隆的主要环节及影响因素
吴志强 四川农业大学
畜牧哺乳动物体细胞克隆技术经过十年的发展与完善，其操作越来越简单，成本逐渐减低，效率也逐渐提高。但动物克隆是一个系统工程，包括供体细胞的准备、卵母细胞的成熟、卵母细胞的去核与注核、重构胚的融合与激活、重构胚的体外培养、胚胎移植和妊娠维持等很多的技术环节，影响因素较多。结合每个技术环节，分析一下猪体细胞克隆技术中潜在的影响因素。
1供体细胞的选择
在体细胞克隆中，供体细胞几乎提供了全部的遗传物质，它决定了克隆后代的遗传性状。供体细胞的准备是体细胞克隆技术最为重要的环节之一，获得大量的同源供体细胞是提高克隆效率的途径之一。虽然构成哺乳动物机体的细胞类型有200多种，但是能够用来作为供体细胞克隆出后代的细胞类型只占很小的比例，不到5%。在猪上，体细胞核移植的供体细胞大多选用胎儿成纤维细胞，研究人员认为来源于胎儿或新生动物的体细胞往往具有较高的克隆效率，原因可能是这些细胞分化程度较低，比较容易被正确的重编程。虽然建立胚胎干细胞系可以提供核移植供体细胞，然而在猪上还没有获得和建立胚胎干细胞系，因此以胚胎干细胞作为核移植供体细胞还不能实现。
此外，供体细胞与受体细胞的周期协调对于核移植的成功也很重要。“Dofly”羊的成功主要是对供体细胞经行了血清饥饿，使其进入GO期。此后很多研究者也纷纷采用血清饥饿的方法处理供体细胞，并获得了不错的效果。但实验证明GO期供体细胞并非克隆成功必需，Dyce等用GZ/M期的细胞进行核移植并成功获得了克隆动物。
2受体卵母细胞的培养
猪体细胞克隆中，最常用的受体是Mn期卵母细胞。由于在猪的体细胞克隆中需要的卵数量较大，同时从经济的角度出发，一般从屠宰场获取大量卵巢，从卵泡中抽取并挑选好的卵丘一卵母细胞复合体，在体外成熟培养至MH期，而超排取卵一般不适合猪体细胞克隆。卵母细胞的体外成熟包括细胞核的成熟和细胞质的成熟两个相互联系的过程，通常细胞核成熟之后其细胞质还没有完全成熟，而细胞质的成熟对于胚胎的发育至关重要。影响卵母细胞体外成熟的因素很多，其中体外成熟培养液的组成成分是至关重要的因素。在组成成分中，胎牛血清(FBS)和卵泡液(PFF)是最常用的两种添加成分，由于其成分复杂、并且具有多种生物活性因子，因此在多种动物的卵母细胞体外成熟培养中都能够起到很好的促成熟效果。我们实验室的猪卵母细胞体外成熟液以改良型的TCM199作为基础培养液，并添加了胎牛血清、猪卵泡液、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素 (PMSG)、表皮成长因子(EGF)等成分，得到了比较好的卵母细胞体外成熟效果。
此外，选择以合适卵龄的成熟卵母细胞作为受体对核移植的成功也很重要。目前常用的卵母细胞主要是成熟培养40一46h左右的卵母细胞。
3重构胚的构建
体细胞核移植操作首先要去除成熟卵母细胞的细胞核，以接受外源的体细胞核。而卵母细胞的去核程度与重构胚的后续发育能力密切相关，去核率越高，去除的胞质越少，重构胚发育到期的概率就越大。在去核之前，通常要对成熟的卵母细胞用一定浓度的细胞松弛素B(CytochalasinB，cB)处理一段时间，以减小去核时对卵母细胞的物理损伤。目前已经发展了多种卵母细胞的去核方法，主要有 Hoechst33342示核法、盲吸法、化学试剂去核法、离心去核法、半卵法、末期去核法、挤压法、蔗糖处理去核法、微分干涉和极性显微镜去核法等等。但这些方法各有优缺点，如示核法或化学试剂处理会对卵母细胞造成损伤，盲吸法的去核率较低等。我们实验室使用的是带有Spindie一View纺锤体观察系统的显微操作去核。
去核后的卵母细胞可作为核移植的受体接受核供体移入。用显微注射针吸取合适的供体细胞，并将其注射到去核的卵母细胞中或者卵周隙内。实验室一般采用卵周隙注射。
4重构胚的激活
在将供体细胞注入到去核卵母细胞的卵周隙之后，并没有形成完整意义上的重构胚胎，还需要将供体细胞的细胞核导入到卵母细胞质中，这个过程称之为融合。常用的融合方法有灭活的仙台病毒介导的融合和电融合，其中电融合已经成为普遍采用的融合方法。具体操作为:调整卵母细胞位置使卵母细胞与供体细胞的接触面与电场方向垂直，然后施加瞬间高强度的直流脉冲，击穿细胞膜，使其通透性发生改变，促使紧密接触的两细胞膜发生融合。同时由于电击在细胞膜上产生的小孔可以引起c扩十的内流，类似于精子入卵时的Ca2+浓度升高的过程。当电脉冲过后，质膜迅速恢复。在融合液中ca2+存在的情况下，可以引起卵母细胞的激活。
猪体细胞克隆中，对重构胚电融合及激活处理之后，一般还对其进行化学激活来启动胚胎发育。且常在重构胚胎体外培养液中添加CB来处理重构胚3一4h，以防止第二极体排出，维持正常的二倍体核型，这样的效果比较理想。
5重构胚的体外培养和移植
激活后的重构胚胎一般要在体外培养一段时间再进行胚胎移植。从融合胚到囊胚阶段的胚胎都可适时移入代孕受体。由于体外培养体系存在的缺陷，也会导致重构胚胎停滞，死亡，流产，死胎或出生后死亡和患有巨胎症 (LargeoffsPringSyndrome，LOS)等异常。
猪体细胞克隆胚胎体外培养中，最常用的体外培养液是NCSU一23，此外还有人研制了PzM一3等新的培养基。如何使胚胎通过发育阻滞阶段，一直是近些年胚胎体外培养的研究热点。最初，人们采用降低气相环境中的氧浓度，采用混合气(90%NZ，5%C02，5%o:)来促使胚胎通过发育阻断，并取得了一定的效果，但是效果并不稳定。有研究发现，与体细胞共培养是促使胚胎通过发育阻断的最为有效的途径，并由此导致胚胎体外生产技术的迅速发展。目前用于胚胎共同培养的体细胞主要有输卵管上皮细胞、滋养层细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、黄体细胞、子宫内膜细胞等。体细胞对胚胎的有利效应，可能是通过分泌生长促进因子、去除培养液中有毒化合物(如重金属双价离子)或降低培养液中02的分压实现的。
猪克隆胚胎移植过程中，保持代孕母体子宫的生理阶段与克隆胚胎的同步是移植成功与否的关键因素。有资料报道，“老胚胎”和“年轻子宫”的兼容性要比“年轻胚胎”与“老子宫”之间的兼容性好。猪克隆胚胎移植多是在1细胞，2一4细胞或4一8细胞阶段采用输卵管内移植，总数一般不低于120枚，且优质胚胎数不能少于4枚，这对于猪的妊娠识别和妊娠维持至关重要。
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