猪萎缩性鼻炎间接ELISA检测试剂盒的研制
余腾 华中农业大学
(l)PET-28b一CZI巧表达载体的构建
使用细菌基因组小提试剂盒提取 T+PmHN一13的基因组，制备PCR的模板，PCR扩增的引物参照表3一 l(PC一1，PC一2)。PCR反应体系为50林L，体系中各组分别为:lox几 qBu价5.0林L， dNTPS2.0林L，上下游引物各1.0件L，ExTaq酶0.5林L，模板2.0林L，灭菌单蒸水加至总体积so.ouL。PeR反应条件是 :94OCsmin;94oC455， 59OC455，72℃3min，30个循环;72oC延伸10min;降温至4OC。扩增目的片段大小为2115bp，上下游分别引入BamHI和Saz鹿切位点。
将PCR扩增的目的片一段经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，验证为目的片段后，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳和DNA回收试剂盒进行回收，回收产物取1抖L进行电泳，验证其是否为回收产物以及初步估计回收产物的浓度，随后将回收产物经Ban仔刀和Sall进行双酶切，并经1.0%的琼脂糖凝胶电泳和DNA回收试剂盒进行回收，得到回收产物I;同时将质粒PET-28b经Ba。刀了和Sall进行双酶切，酶切产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳和DNA回收试剂盒进行回收，得到回收产物n。将产物I和产物n各取1拼L进行电泳，初步估计两种回收产物浓度的大致比例，按照一定的质粒和载体量加入到灭菌的EP管中，在T4连接酶的作用下，4℃过夜连接。
(2)感受态细胞的制备和转化
感受态细胞选用大肠杆菌DHS。或BLZ，(DE3)，制备方法通过氯化钙法制备感受态细胞，感受态制备的具体操作过程参照《分子克隆实验指南》(第三版)中的方法进行。
连接产物的转化:取装感受态细胞(DHS。或BL21)的EP管放置于冰上，将4℃过夜的连接产物加入到盛装有感受态细胞的EP管中并混匀，接着将EP管在冰上放置 30min，然后将其放入42OC水浴中，热击905，再放回冰上Iomin，向热击后的EP管中再加入400件LLB液体培养基，在37℃20Or/m的摇床中培养45min，取出EP管，8000r/m离心smin，弃部分上清，留约100拼L上清与菌液混匀，并将其均匀涂布于含25件g/mL卡那霉素(KZ:)抗性TSA平皿，37OC培养至有单菌落出现(24h后还无单菌落出现时，则需重新连接连接双酶切产物，并重新进行转化)。转化子的验证:挑取在KZ:抗性TSA平皿上生长出单菌落，在加有KZ:的TSB液体培养基中培养12h，提取质粒，分别进行BamHI和Sall双酶切和PCR，验证重组质粒是否构建成功。此重组质粒命名为PET-28b一C21巧，重组蛋白命名为PM工 CZ115。
(3)重组蛋白的表达和纯化
将构建成的PET-28b一C21巧重组质粒转化感受态细胞BLZ，，挑起阳性转化子进行诱导表达。其表达过程如下:挑起阳性转化子，加入到含有K25的TSB液体培养基中培养8h，放入4℃冰箱过夜。第二天将50林L含转化子和空质粒菌液分别加入到含有K25的 smLTSB液体两瓶培养基中，在37℃条件下振荡培养约3h，至OD6DO达到0.6一1.0时，加入5件 L1.omol几异丙基硫代一p一D一半乳糖普(IPTG)，继续培养4h，每隔lh(第l、2、3、4h)取O.smL菌液分别收集于Ep管中。将8管收集的细菌， 8000r/min离心 5min，弃上清，先加入50件L灭菌单蒸水混匀，再加入50林LZxsDS上样缓冲液，混匀后沸水煮沸10min，于12%的SDS一PAGE检测重组蛋白的表达情况。SDS一PAGE胶的下层胶上层胶的配制，参照《分子克隆实验指南》(第三版)中的配方进行。表达蛋白的可溶性判定:取诱导表达4h后的细菌培养物50mL，通过 8000r/m离心 10min，收集菌体，加2.smL的PBs重悬，超声波破碎巧min(冰上操作)，然后在4’C条件下， 12000r/m离心巧min，分别收集上清和沉淀。沉淀加入2.smL的PBS重悬，分别取50林L上清和50林L沉淀，并分别加入50卜LZ‘SDS上样缓冲液，混匀后及作为SDS一队GE电泳样品。
对于37℃条件下诱导产物大部分在包涵体中的情况，尝试采用低温低IPTG长时间诱导的方法，使诱导产物在分泌在细菌细胞内。其具体操作方法同前方法类似，只是菌液诱导温度和IPTG终浓度有所不同，低温诱导采用的是 0.1~o1/LIPTG28℃诱导10h和 0.01~ol/LIPTG20℃诱导ZOh。接着按照前面介绍方面制备上样液，于12%的SDS一PAGE检测重组蛋白的表达情况，并分别检验表达蛋白的在上清和沉淀中的含量。
重组蛋白的纯化:(1)按照Ni2+离子交换柱说明书的介绍，将填料进行上柱，固定柱子后静置10min，待填料和上清液面出现清晰的分界线后，将一与交换柱内径相当大小的滤纸片轻轻盖在分界处。(2)打开交换柱的出口，将柱中液体放出，当上清液面即将降至滤纸片时，加入结合缓冲液(体积为填料总体积的3倍，约25mL)进行清洗填料。(3)待洗涤液液面接近滤纸片时，加入可溶性重组蛋白，加入体积不超过填料总体积的2倍，约10mL。此时应降低交换柱出口液体的流速，使带组氨酸标签可溶性重组蛋白与Ni2+离子填料充分接触鳌合。(4)待液体液面接近滤纸片时，再加入结合缓冲液进行清洗，结合缓冲液体积约是填料体积的5倍(约25mL)。(5)待洗涤脱液面接近滤纸片时，加入结合缓冲液，其体积约为填料体积的2倍(约IOmL)，同时将洁净的EP管放置交换柱出口处，开始盛接洗脱下来的液体，每管盛装lmL左右，盛接洗脱液共计10管左右。待洗脱液降至滤纸片时，加入5倍填料体积的结合缓冲液，同时停止盛接洗脱液。(6)待结合缓冲液液面接近滤纸片时，加入10mL20%乙醇。待5mL20%乙醇流出后，关闭交换柱出口，并放4℃条件下保存(注意保存时要保持填料在20%乙醇中浸泡)。在盛装洗脱液的EP管中各取10协L，分别加入10拼 LZxSDS上样缓冲液，混匀后及作为sDs一PAGE电泳样品，进行SDS一PAGE，分析其纯度。将纯度很高的蛋白质通过TE透析3天，测定蛋白质的含量。
(4)表达产物的 westernblot检测
将纯化后的重组蛋白分别进行SDS一PAGE电泳，转膜Zh后进行洗涤显色。具体操作过程参照汤细彪博士论文中的方法进行。
(5)重组蛋白的方阵滴定试验
将纯化后并已经测定出蛋白含量的重组蛋白 PMT-CZ115，按1:100、1:200倍比稀释到1:12800，分别加入到酶联板1至8行，每行包被蛋白浓度相同，每孔加入重组蛋白和包被液总体积100林L。将其于37℃温箱中温育lh，然后放置于4OC冰箱中过夜;次日取出酶联板用洗涤液洗3次，每次间隔3一smin;然后每孔加入120件L封闭液，37oC封闭3Omin;将阳性血清按l:10、l:20倍比稀释至1:320，加入到酶联板的第l至第6列，每列阳性血清稀释倍数相同;阴性血清也按1:10、1:20倍比稀释至1:犯0，加入到酶联板的第7至第12列，每列阳性血清稀释倍数相同，酶联板每孔血清总体积为100林L;在37℃温箱中温育 30min后，用洗涤液洗3次，每次间隔3一smin;加入羊抗猪二抗100协L/孔(科前公司生产稀释后的酶标二抗)，37℃反应30min，通过洗涤液洗涤5次后加入底物液A和B各50林L，反应 10min后，加入50卜L终止液C终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值。
结果的判断标准:在相同的抗原包被浓度情况下，相同比例稀释度的阳阴性血清对应的OD630值之比(P/N)值最大时，其对应的抗原包被浓度和血清稀释度分别为最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度。
(6)ELIsA阴阳界限值的确定
采集不含有产毒素多杀性巴氏杆菌或PMT毒素的疫苗免疫，以及无萎缩性鼻炎临床症状的猪萎缩性鼻炎阴性血清190份，分别进行间接ELISA检测。设置标准阴、阴阳性对照。计算待检阴性血清的平均值(x)和待检阴性血清的标准偏差(SD)。求得阴阳界限值为X+ZSD值。
(7)ELISA操作方法的优化
主要是对封闭液的选择和封闭时间，待检血清的温育时间，二抗温育时间分别进行优化。封闭液选择含0.5%，1.0%，1.5%BSA和2.5%，5.0%，7.5%脱脂乳，封闭时J司选择30，45，60min几个梯度进行优化;待检血清温育时}‘司设置15，30，45，60min等四个时间梯度进行优化;二抗温育时间也设置15，30，45，60min等四个时间梯度进行优化。
(8)ELISA检测方法的特异性
使用所建立的间接ELISA方法分别检测致猪水肿病大肠杆菌、猪沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、Bb、T一Pm等细菌病原的阳性血清，以及猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合症病毒、猪口蹄疫等病毒病原的阳性血清，同时设立阴、阳性对照，观察上述各血清与产毒素多杀性巴氏杆菌阳性血清的交叉反应情况。
(9)ELISA检测方法的敏感性
用甲醛灭活的PMT粗提物免疫5头PMT抗体阴性的健康猪，分别于免疫后7d、 14d和29d采血分离血清，对各时间段的血清进行ELISA检测，确定其敏感性。
(10)ELISA检测方法的批内和批间重复性
批内重复性试验:随机取3块同一批包被重组蛋白的酶联板，检测8份己知背景的猪血清，阴、阳性血清各4份，通过优化的间接ELISA方法，检测同一份血清在不同孔中oD值，验证同一批包被酶联板之间的稳定性，并计算变异系数CV(标准差与平均值之比)。
批间重复性试验:随机抽取3块不同批次包被重组蛋白的酶联板，检测8份已知背景的猪血清，阴、阳性血清各4份，通过间接ELISA方法，检测同一份血清在不同批次酶联板孔中OD值，验证不同批包被酶联板之间的稳定性，并计算变异系数CV。
(11)保质期试验
将重组蛋白按照确定的最佳包被浓度，一次包被10块酶联板，将其放入4℃冰箱中保存，分别于0个月、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月分别取出一块，通过间接ELIsA方法进行检测，每次检测相同的8份血清(血清开始就进行分装，并放入一80℃冰箱中冻存)，观察血清的OD630值变化情况，确定其保质期。
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