猪萎缩性鼻炎巢式PCR检测试剂盒的研制
余腾 华中师范大学
1.PCR模板的制备
在TSA上生长的单菌落，直接用接种环挑取，重悬于盛有50μL无菌单蒸水中的EP管中，煮沸10min，然后速置于冰上冷却10min，随后12000r/m离心smin，上清即为PCR模板;对于临床采集的鼻拭子样品，先将鼻拭子放入TSB液体培养基中培养6一sh，随后12000r/m离心10min，取出棉拭子，弃上清，加入50微升无菌单蒸水重悬，在微波炉中煮沸10min后，速置于冰上冷却10min，然后12000r/m离心5min，上清液即为PCR模板。
2.巢式PCR反应体系的优化
巢式PcR的反应体系都设定为25微升， 10 x Taq Buffer为2.5微升，第一轮PCR模板量为6微升，第二轮PCR模板量为2微升。将Taq聚合酶，引物和dNTPs分别配制不同浓度，加入到PcR反应体系中，最后加入灭菌的单蒸水至总体积25微升。第一轮，第二轮PCR反应的每个反应体系中Taq聚合酶的量分别设定为0.5u，1.0u，1.5u，2.0u，2.5u，3.0u等六个梯度;引物的终浓度分别设定为0.16微摩尔/升，0.24微摩尔/升，0.32微摩尔/升，0.4微摩尔/升，0.48微摩尔/升等五个浓度梯度;dNTPs的终浓度分别设定为0.02mmol/L， 0.03mmol/L， 0.04mmol/L， 0.05mmol/L， 0.06mmol/L等五个浓度梯度。
3.巢式PCR反应程序的优化
巢式PCR的第一轮，第二轮PCR反应的预变性温度和时间都设定为94OC，smin，延伸温度都设定为72℃，循环数为30，最后一轮循环后，72摄氏度延伸5min，随后降至40摄氏度保存。第一轮PCR变性温度和时间分别设定为94OC，305;退火时间为305;第二轮PCR变性温度和时间分别设定为94OC，355，退火时间为355。对第一轮，第二轮PCR反应分别设置不同的退火温度和延伸时间进行PCR反应。
4.巢式PCR检测方法的敏感性
将 T+PmHN一13在TSA平皿上进行划线培养，挑取单菌落放入TSB培养基中，在37℃条件下培养sh，随后将其进行10一‘、10一2、10一“…10一8倍比稀释，最后三个稀释度的菌液各取100仁L进行平板记数，每个稀释度有两个重复，同时将各个稀释度的菌液各取100卜L按照3.2.1.1中的方法制备PCR模板，每个稀释度做分别制备两个重复。将制备好的模板进行巢式PCR，确定其方法的敏感性。
5.巢式PCR检测方法的特异性
分别提取大肠杆菌、Bb、T一Pm、猪霍乱沙门氏菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌等菌的基因组，分别运用本方法进行巢式PCR，验证其方法的特异性。
6.巢式PCR检测方法的可重复性
将巢式PCR反应体系中的引物，1价 TaqBuffer，dNTPs等试剂在-20℃条件下经过几次反复冻融，随后对T+Pm的基因组提取物进行巢式PCR扩增，确定巢式PCR检测方法的可重复性。
7.巢式PCR方法与其它方法的符合率试验
用本研究中优化的方法与ehangsun等畜牧研究人员建立的巢式PeR方法对临床采集的一批鼻拭子样品进行检测，进行两种检测方法的符合率试验，根据检测的结果，验证两种巢式PCR方法的符合率。
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