猪戊型肝炎病毒的诊断方式
刘启文 上海师范大学
由于猪自身感染 HEV 无明显临床症状，要判断猪是否感染 HEV 要通过实验手段来检验。猪 HEV 和人 HEV 在遗传学上没有太大差异，用于人 HEV 的诊断方法也可用于猪 HEV 的诊断。近几年基层兽医已经建立了一系列特异性的诊断方法：
1 酶联免疫吸附实验（ELISA）：
是目前用于检测血清 HEV 抗体最常用的一种方法，具有操作简便快速，费用低，敏感性高，特异性好的优点，检测的血清抗体主要是 IgG、IgM 和 IgA，是目前在实验室辅助诊断和流行病学调查中最常用的方法和研究热点。其中以间接 ELISA 用途最广。用于检测HEV的抗原有三种即：组织培养全病毒抗原，合成肽抗原和表达抗原，目前最受关注的是表达抗原。常用的表达抗原有ORF2的表达抗原，ORF3的表达抗原以及同时含有ORF2和ORF3编码产物的重组表达抗原。
2 PCR方法：
用于检测HEV最常用的是巢式逆转录- PCR（巢式RT- PCR），这种方法可以较灵敏的检出含量减少的RNA基因组。由于戊肝病毒的基因型不同，因此用于PCR的引物设计非常关键。用RT-PCR方法检测时，血清阳转前1-2 周可检测到HEV RNA ，绝大多数样本血清阳转后测不出RNA，其在戊肝发病后血清和粪便中的病毒量均迅速降低，检出窗口较短，因此对采样时间有较高要求。已有很多学者利用染料SYBR Green和探针TaqMan来标记ORF2 和ORF3 基因的实时定量PCR来检测HEV RNA，而且用传统的巢式RT-PCR方法检测出来的阴性血清可以用实时定量PCR方法检测出HEV 微粒。
3 PCR 产物限制性长度多态性（PCR-RFLP）：
首先进行巢式 RT-PCR，其次是用一定的限制性内切酶对 PCR 产物进行酶切，电泳观察片段差异，最后确定 HEV 基因型，不用进行 PCR 产物的测序鉴定。
4 免疫电镜（IEM）：
免疫电镜法是最早用于检测 HEV感染的手段，以实验感染动物的急性期、恢复期血清作已知抗体检查待测粪便、胆汁标本中的 HEV 颗粒，以观察到粪便标本中有由抗体包裹的 3 个以上病毒颗粒或经与抗体反应后的病毒凝集物至少 3 个以上则判为阳性，如仅见 1 个或 2 个这样的病毒颗粒，应再次检查此标本，如仍有病毒颗粒或上述的凝集物存在则判为阳性。该法的优点是直视可靠，但敏感性差，且特异性抗体来源有限和需用电镜，这就使其应用受到了较大的限制。该法的优点是直观可靠，但敏感性差，对仪器设备和检测人员素质要求较高，这就使其应用受到了较大的限制。
5 免疫荧光试验（IFA）：
该法用于 HEV 抗体的检测，在HEV 感染期间，免疫荧光实验可检测到肝细胞组织中的 HEV 的特异性抗原。用荧光素标记纯化的抗-HEV-IgG 去检测实验感染猴肝组织中的 HEV-Ag，敏感性可达 90%以上，通过免疫荧光阻断法证实其有高度的特异性，与其他型肝炎间无交叉反应。本法敏感性、特异性均高，但需取肝组织检查，故其应用也受到一定的局限。
6 免疫印迹（IB）：
常用 Western 转印法（WB），多采用重组的表达抗原检测血清中的 HEV IgM 和 IgG 抗体。虽然 WB 法检测特异性高，但操作技术相对复杂，检测所需时间较长，目前未有商品的试剂供应，因此该法更多用于 HEV 的实验室研究。
7 原位杂交（ISH）：
原位杂交即组织原位杂交，是在细胞保持基本形态的情况下，将探针注入细胞内与 RNA 或 DNA 杂交。杂交反应在载玻片或其他支持物上的细胞内进行，根据所用探针的种类和要检测核酸的不同，可分位为DNA-DNA，RNA-DNA 及 RNA-RNA 杂交。用于原位杂交的探针可以是单链或双链 DNA 或 RNA，探针的标记物可以是放射性的也可以是非放射性的。ISH 敏感性高，可以精确定位 HEV 病毒或其 RNA 在细胞中的部位，为进一步深入研究其致病机理提供帮助。
Choi 等用非放射性地高辛标记的 289bP 的 cDNA 探针，对石蜡包埋的组织切片进行原位杂交，结果肝细胞和胆囊切面内出现很强的信号，同时阳性信号也出现在小肠，大肠，淋巴结，扁桃体，脾脏和肾脏，用 PCR 法进行验证，符合率 100%，其中，肝脏中阳性率最高，其次是大肠、小肠、胆汁、脾脏、淋巴结、扁桃体和肾，原位杂交检测阳性链的 HEV-RNA 并为细胞定位和组织学构架提供详细资料。
8 异源双链核酸分子电泳迁移测定法（MHA）：
该法能在不测序的条件下，快速鉴定出基因序列密切相关的不同分离株之间的相似程度。其原理是当分离株和参考株的 DNA 分子混合，进行退火变性，然后复性，在复性时，两个密切相关的单链 DNA 分子就会形成异源双链核酸分子，异源双链核酸分子中错配或不配对的碱基造成结构的变形，使其在 PAGE 电泳中迁移速度变慢，迁移率下降的程度反映了分离株与参考株之间的变异程度。
Sun 等用猪分离株做参考株，分别和 22 个猪 HEV 分离株进行混合，用简并引物扩增 ORF2 区，用同样的方法扩增 13 个禽 HEV 分离株与禽 HEV 参考株的 ORF1 区，用 8%的 PAGE 分离 PCR 产物中的同源和异源双链核酸分子，根据电泳图谱确定各分离株和参考株之间的关系，结果发现通过 HMA 图谱得出的分离株的关系与核昔酸序列同源性计算和进行树绘制得到的结果很吻合。
9 树状 DNA 杂交技术（DDH）：
DDH 是一种基于核酸杂交的信号放大技术，通过增加标记探针的拷贝数或标记物的信号强度来提高敏感性。赵秀丽等利用 DDH 对 25 份 RT-nPCR 检测 HEV 阳性标本的逆转录产物的检测均显阳性。单祥年等对 HEV 5 个不同基因型和亚型逆转录产物 DDH 检测也呈阳性，证明树状 DNA 杂交技术检测 HEV 病毒有较好的敏感性和通用性。但 DDH 技术作为一种新的检测技术也有固有的缺陷，例如实验中核酸固定、预杂交和杂交都需要比较长的时间，实验步骤比较繁琐，参数不易控制，且难以用于直接杂交检测等，这些都是 DDH 技术推广应用所必须解决的问题。
10免疫色谱技术：
2005 年 Chen 等报道了一种在血清中快速检测 HEV IgM的免疫色谱技术。这个技术利用了 HEV ORF2 端区域（氨基酸 394-660）重组蛋白 EP211 和单克隆抗体 4B2，基于一种新的逆流技术，可以在 2-3min 内得出结果，这项技术可以应用到现场和紧急情况以及资源缺乏的国家。
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