粪臭素的分析方法
李凤 西南大学
粪臭素的检测有比色法、正相和反相高效液相色谱法(HPLc)、气相色谱法以及Lc一Ms等多种方法。比色法基于粪臭素与二甲胺硼烷在室温下混合后生成的有色化合物在580nm有最大吸收，可进行比色分析。可将含粪臭素的提取液与1.5倍体积的1%二甲胺硼烷乙醇(75%)硫酸溶液混合，在室温下显色3min后测定ssonm下的吸光度值。采用Hypersil砂52氨丙基键合硅胶柱以正己烷:异丙醇(92:8)作为流动相对含粪臭素的提取液进行分析，荧光检测的激发波长为280nm，发射波长为360nm。检测的线性范围为0.05一1卜吮和0.05一0.4卜吮背部脂肪时，相关系数分别为0.9916和0.99。
M.Dehnhard等采用反相色谱柱以冰醋酸一异丙醇(70:30，V戊)为流动相进行HpLc分析，检出限达到4。g/g脂肪。 JensHansen一Moller等用BondElutcls反相柱完成HPLc分析，粪臭素的检测限达到1和g/kg背部脂肪128]，并且他们还采用 HypersilODS反相柱测定了猪背部脂肪中粪臭素的含量并和比色法得到的结果进行了比较。
采用如下的流动相:(A)四氢吠喃一 25mMpH6.。磷酸盐缓冲液一冰醋酸(31:67.6:1.4，v理)，(B)四氢吠喃一乙睛一 25mMpH6.0磷酸盐缓冲液一冰醋酸(34:23.8:41.4:0.8，v/V)，(C)四氢吠喃一水(90:10，V/V)进行梯度洗脱，荧光检测器激发波长为285nm，发射波氏340nm。检测限可达30n吮背部脂肪，并同时采用比色法测定。384个样品测定结果比较表明HPLC和比色的结果良好相关。上述结果与他们早些时间的研究结果一致。而Hawe等的研究结果显示比色法和GC法的结果一致性较差，其研究样本中粪臭素的平均含量较低接近比色法的检测限可能是导致这个结果的原因。
MPorte:使用极性毛细管柱和火焰离子检测器对粪臭素进行了气相色谱分析，并可同时检测叫噪。Kverheyden建立了采用Lc一Ms同时分析粪臭素、叫睬和雄烯酮的方法。液相色谱采用C18柱，以甲醇(A)一1%醋酸(B)为流动相进行梯度洗脱 (50%A:50%Bomin， 100%A7min， 100%A17min)。
质谱分析采用带大气压化学电离(APCI)接口的LTQ线性离子阱质谱仪。分析条件为汽化温度400℃，鞘气40，辅助气 5Aib，毛细管温度275℃，毛细管电压2V，Tubelens补偿电压60v，采用全扫描和子离子扫描分析模式。方法线性范围为50一1600陀瓜g背部脂肪，线性相关系数为0.997。结果表明方法的回收率，准确性和检出限都与样品的前处理有很大关系，样品基质对粪臭素的分析影响比较小阵。
夏枚生等采用c18柱以乙睛一水(60:40，v/V)作流动相，荧光检测器激发波长270nm，发射波长350nm，对发酵液中的粪臭素含量进行了分析。郑均杰等采用oDs柱并以乙酸一异丙醇(70:30，V/V)为流动相，流速1.smUmln，荧光检测器的激发波长281nm、发射波长352nm对样本中的粪臭素进行了测定。结果显示标样在120ng/mL浓度范围内的线性良好。李家胜等采用 EcipsexDBcs柱以乙睛一水(40:60，v阿)为流动相，荧光检测器激发波长270nm、发射波长350lim，分别对皮下脂肪、背最长肌肉和血清中的粪臭素进行了测定。进样量在0.27一3.32ng范围内的线性相关性在0.999以上。李彩燕等采用 EciPseXDBCS柱，经比较甲醇一水和乙睛一水分别做流动相后，应甲醇一水体系柱压较高而选择了乙睛一水作为流动相进行梯度洗脱，荧光检测器的激发波长280nm、发射波长350nm，检测结果显示粪臭素在1.15一73.386的浓度范围内线性相关系数达0.9998，检出限达0.88卜mol几，定量限达2.95卜mof几。
梯度洗脱的原因主要是因为同时还检测L一色氨酸、叫垛一3-乙酸。董利文等采用cBPI一w25一100型大口径毛细管色谱柱以正十二烷做内标，在初温85℃，保持lmin，以15℃/min升温至230℃，保持smin，样品与溶剂、杂质峰、有较理想的分离效果，粪臭素的浓度在5一25mL浓度范围的线性相关系数达0.9997，加标回收率在99.73一100.04%间，测定简单快速。顾媛等使用c18柱在进行乙睛一水和乙酸溶液一异丙醇两种流动相后采用乙睛一水(40:60，V阿)为流动相分析粪臭素的含量，在3一120n岁mL浓度范围内峰面积和浓度的线性相关系数达0.9999，进样时，粪臭素的检出限为0.08，定量限为0.26n吮，方法的精密度和可信度较高。代敏等采用Gc一Ms分析了保鲜乳中粪臭素的含量。MS采用EI离子源，全扫描方式扫描，离子源温度200℃，接口温度250℃。定量方法采用标准物质峰面积与内标物质峰面积之比为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线。粪臭素在0.05一。
.4卜叭的浓度范围内线性相关良好哪]。刘旭辉以水一甲醇(40:60，V戊)为流动相对粪便固体发酵前后粪臭素的含量进行了HPLc分析。 MTuomola等采用HPLc分析了猪脂肪组织、血清和涎腺中粪臭素的含量脾。俞小辉等采用 HPLc分析了仔猪粪便发酵仔猪日粮后产生的粪臭素含量I钊。李平对微生物发酵液离心后进行HPLc分析，采用甲醇一水作为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长225nm因。从目前的研究情况看，荧光检测具有好的灵敏度、特异性和宽的线性范围，峰面积和浓度的线性相关性良好，已经成为检测粪臭素含量的成熟方法。在粪臭素含量较高的时候采用紫外检测也具有较大的线性范围和良好的相关性。
目前实验室检测粪臭素的方法已经具有一定的灵敏度、专一性和准确性，线性范围大，线性相关性良好。粪臭素本身能发荧光，仅分析粪臭素可采用荧光检测器既方便又具有高的灵敏度。并且粪臭素也可采用紫外检测器检测。但是当含量比较低的时候为了提高检测的灵敏度通常采用荧光检测。粪臭素和其他组分的分离采用 HPLC通过调整流动相组成和洗脱梯度等也比较容易实现。样品检测的耗时主要是样品的前处理，并且样品前处理的好坏也直接影响后续的分析方法的选择应用和分析结果。因此样品的前处理是粪臭素分析的重要研究内容。另外在实践应用的分析中通常还需要同时检测像雄烯酮及其他的对擅味有影响的物质，这样样品的前处理和检测方法的选择就更加的复杂一些。因此在选择粪臭素的检测方法的时候必须考虑样本的基质特点、粪臭素的含量水平以及是否要同时检测其他对擅味可能有贡献的其他组分，从而选择适宜的样品处理方法和分离纯化系统以及适当的检测器和检测的波长。
以上的检测方法都主要适用于实验室的研究分析，分析全过程耗时较多，不能满足畜牧屠宰线上的快速检测的需要，品种选育的高通量筛选也迫切需要快速的检测方法。因此建立粪臭素的快速、简便和可靠的检测方法是许多实验室一直努力的目标。
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