猪流感的分子生物学诊断技术
高蕾 浙江大学
由于传统的诊断方法操作繁琐，诊断时间长，结果重复性不好，限制了传统方法在实际中的应用，但是传统方法在病毒的初次分离和亚型鉴定中还起着重要的作用。随着分子生物学的发展，应用分子生物学诊断技术进行猪流感快速诊断和鉴定已成为国内外研究猪流感的有效手段之一。分子诊断技术具有特异性好、灵敏度高、针对性强、诊断快速等优点。
聚合酶链式反应( PCR) 在许多实验室里已广泛应用 PCR 方法来检测流感病毒，且检测的敏感度达到了 pg 水平。PCR 可用来鉴定分离的病毒，也可直接用于临床病料的检测，因此 PCR 能对疾病作出早期诊断。因其技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，故是生物学最有价值的研究手段之一。针对 A 型流感病毒的诊断，Atlnar( 1996)建立了 RT-PCR 方法。针对流感病毒具有多种型和亚型的情况，Wright( 1995) 建立了区分型和亚型的 PCR 法。
近年来，一些基于不同靶基因的 RT-PCR 检测方法在国外相继建立。Ellis 等建立了检测和鉴别不同物种 A 型流感病毒的 RT-PCR 异源双链核酸分子迁移试验( RT-PCRheteroduplex mobility assay，RT-PCR HMA) ，可早期识别动物流感和人流感的种间传播。祈贤等针对SIV 保守基因NP 建立了套式RT-PCR，用于猪流感的检测。Young 等( 2002)建立了多重 RT-PCR 来检测和鉴别 H1 型和 H3 型猪流感病毒，并且与血凝试验结果相符合，结果表明所建立的多重 RT-PCR 可用于检测临床样品中不同亚型的猪流感。Jurgen等( 2004) 建立了针对 A 型猪流感病毒 Vl 基因的实时 RT-PCR，用来检测和区别 H1 和H3 亚型猪流感。与病毒分离相比，实时 RT-PCR 的敏感性为 94%，特异性为 85%，H1，H3，N1 和 N2 特异性引物和探针检测的敏感性低于 M 基因的检测。
实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR 技术，是一种核酸定量技术，它是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法; 该技术不仅实现了对 DNA 模板的绝对定量，而且能实现多重反应，自动化程度高、无污染性等特点。该技术可以通过不同的解链温度来区分出 H1N1 亚型流感病毒和其他 H1 亚型的流感病毒。相比普通的 RT-PCR，其更灵敏、快速( 约 50 min) 、安全和特异性高，可以实现对病原体的核酸的定量，但不可否认的是荧光 PCR 仪比普通的 PCR 仪要贵几倍甚至是几十倍，目前还不能广泛应用于生产实践。近几年国外相继有报道该法用于 SI 的诊断。2009 年 5 月，美国食品药品监督管理局( FDA) 和美国疾病预防控制中心( CDC) 推荐使用 AppliedBiosystems7500 Fast Dx 实时定量 PCR 仪或 7500 实时定量 PCR 仪进行甲型 H1N1 流感病毒的检测，但该方法需要配置专门的荧光 PCR 检测仪，检测试剂也较贵。
依赖核酸序列的扩增法 依赖核酸序列的扩增技术也就是 NASBA 技术，是一种扩增 RNA 的新技术，反应在 42℃ 进行，拥有比 PCR 更高的扩增效率( 可以在 2 h 左右将模板 RNA 扩增约 109 倍) ，不需特殊的仪器，即使在有 DNA 污染或存在的情况下，同样不受影响。该技术特别适用少量 RNA 分子的检测，错配率低，特异性强，操作简便、灵敏度和准确率高，不受抗体的影响，适用检测标本范围广泛，时间短( 6 h) 。目前，国内还没有关于该方法应用于 SIV 检测的报道，由于 SIV 和 AIV 同属 A 型流感病毒，NASBA 技术在流感病毒检测上应用前景广阔。
核酸探针技术 核酸探针技术原理是碱基配对，互补的 2 条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。Junk 等( 2002) 用非放射性地高辛标记的 582 个碱基 cDNA 探针来检测 A 型 H1N1 猪流感病毒编码核蛋白的 RNA，阳性细胞呈明显的暗黑色，证明该探针有较好的特异性和敏感性。
基因芯片技术 基因芯片是生物芯片( 包括基因芯片、蛋白芯片和芯片实验室) 中发展最为成熟的一项技术，它是将大量已知 DNA 序列的探针通过一定方式固定于某种固相载体表面，形成致密、有序的 DNA 分子点阵; 该技术以高通量、微量化、污染少、可多基因多标本平行检测等特点被广泛应用于病原分型和疾病诊断等。杨林等利用该技术已成功检测 H1N1 /H3N2 /H5N1 型 SIV，证明该方法敏感性高、特异性好。2009 年 5月，中国军事医学科学院军事兽医研究所研制出一种新型基因芯片，借助这种芯片能在5 h 内获得检测结果。这种基因芯片能够用来检测 1-16 亚型的甲型流感病毒，并且可以对当前流行的甲型 H1N1 流感病毒进行特异性检测，还可以对 H1，H 3，H 5，H 7，H 9 亚型流感病毒进行分型检测。
蛋白质芯片 蛋白质芯片是继基因芯片后发展起来的生物检测技术，其基本原理是将大量蛋白质有规则地固定在介质载体上，利用蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测蛋白质的一项技术。利用该技术可同时对多种蛋白质( 如流感病毒基因组 8 个基因片段共编码的 10 种蛋白: 血凝素( HA) 、神经氨酸酶( NA) 和离子通道 M2、聚合酶蛋白 PB1，PB2、PA，PB1-F2 和核蛋白( NP) 、基质蛋白( M1) 和非结构蛋白 2 ( NS2) 、非结构蛋白 1 ( NS1) 进行检测，使用常规方法需要上千次才能完成的任务在蛋白质芯片上仅需 1 次即可完成，目前检测到的平衡数据误差更小、更准确。M 检测法 此法为近期美国食品药物管理局认证的内源性病毒编码酶检测法。A 型和 B 型 流 感 病 毒 的 包 膜 表 面 存 在 M ， 可 将 含 α - 酮 糖 N- 乙 酰 神 经 氨 酸( N-acetvlneuraminicacid，Neu5Ac) 的底物水解。将新合成的 Neu5Ac 标记上色素原，形成 M 底物，当存在 A 型和 B 型流感病毒时，含有色素原的底物被病毒的 M 分解，释放出色素原，可通过光测定装置进行检测。由于 M 检测法所采用的底物只能被 A 型和 B 型流感病毒 M 分解，所以 M 检测法只能用于 A 型和 B 型流感病毒的检测，而不能用于 C 型流感病毒的检测。Novola 等应用标准板 M 试剂盒对 196 份临床标本进行检测，并与病毒分离进行比较，结果其敏感性高达 96%，特异性为 77%，阳性符合率59%，阴性符合率为 98%。该方法简便、快速及敏感性极高，适用于各个基层及病毒实验室进行临床诊断。
传统的诊断方法中有些操作繁琐、费时，结果重复性不好，特别是流感病毒的血清型多，变异株也不断出现，所有这些限制了传统方法在实际中的应用，但传统的诊断方法在猪流感病毒的初次分离和亚型鉴定中起着重要的作用。随着分子生物学的发展，基于分子生物学建立的方法，如聚合酶链式反应、实时荧光定量 PCR，NASTB 法、核酸探针技术、内源性病毒编码酶检测法、基因芯片技术、蛋白质芯片等，为快速准确的诊断和检测猪流感提供了有效的方法。随着科学技术的发展，应把传统的猪流感诊断方法和现代的分子生物学诊断新技术有效地结合起来，不断改进诊断方法和技术，SI 的诊断方法必将进入一个新的阶段，将为控制和消除 SI 提供必要的技术保障。
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