猪流感的传统诊断技术
高蕾 山东农业大学
1.电镜观察
通过电镜技术，观察 SIV 的病毒粒子，呈椭圆形，棒状和圆形，直径约为 80 － 120 nm。虽然电镜技术直接、客观，但是对病毒滴度不仅要求高，设备昂贵，而且需要熟练的技术操作人员，故临床检测价值较低。
2.病原分离和鉴定
目前实验室中多采用细胞培养来分离病毒，但流感病毒对鸡胚接种较敏感，故经常用鸡胚来分离培养流感病毒。初次采集的标本（鼻腔洗液、鼻咽拭子等），一般采用鸡胚羊膜腔接种法或羊膜腔和尿囊腔同时接种，以提高接种的阳性率。流感病毒的传代培养用鸡胚尿囊腔接种法 。王连想等在 2003 年报道分离了猪流感病毒广东株并鉴定其为 H1N1 亚型毒株; 许传田等在 2004 年报道从山东各地疑似流感发病猪分离并鉴定到 A 型流感病毒 H9N2 亚型; 李海燕等报道通过病毒分离和鉴定首次发现我国猪群已出现 H5N1 亚型流感病毒。
3.血清学诊断
血清学技术是鉴定常规亚型最实用的诊断方法，主要包括红细胞凝集试验( hemagglutination，HA)和血凝抑制试验( hemagglutination inhibition，HI)，神经氨酸酶抑制试验( neuraminidase inhibition，NI)，琼脂扩散试验( agargel immunodiffusion，AGID) ，中和试验 ( serum neutralizationtest ， SN) ，免疫过氧化酶单层细胞试验( immunoperoxidase monolayer assay， IPMA)，免疫荧光法( immunofluorescence assay，IFA) ，免疫组织化学( immunohistochemistry，IHC)以及酶联免疫吸附试验( enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA) 。
3.1红细胞凝集试验( HA)
SIV 颗粒表面的 HA 蛋白具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。DucaM 等在1942 年建立了 HA-HI 试验，由于血凝试验方便、快捷、易于操作，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。血凝抑制试验( HI)：血凝抑制试验敏感、特异，常用于甲型流感病毒亚型的鉴定和抗原变异的分析，需要注意的是，许多动物血清中有非特异性血凝因子，可能产生假阳性，故通常用高碘酸钠法或受体破坏酶( receptor destroying enzyme，RDE)去除非特异性抑制因子。
3.2神经氨酸酶抑制试验( NI)：
NI 主要用于鉴定流感病毒的表面抗原 NA 的亚型。1983年，Van Deuson 等建立了微量 NI 试验方法，既降低了抗原用量，又可对多种分离物同时进行抗原分类，此法一直被世界卫生组织推荐用于 NA 亚型的分类。美国国立兽医实验所已将该方法列为流感病毒分离物定型及筛选畜禽血清亚型 NA 抗体的常规方法。
3.3琼脂扩散试验( AGID)：
AGID 是在琼脂凝胶中进行的免疫沉淀反应，其主要优点是快捷、简便，而且比较保守，基本不发生变异。由于 SIV 的不同亚型都具有型特异性抗原( NP 蛋白) ，故可用一种流感抗原或抗体检测所有抗体或抗原。用标准抗原监测抗体时，标准抗原可以是全病毒，也可以是基因产物。AGID 所用的抗原和抗体的一种必须纯化，否则，易产生假阳性。另外，AGID 的敏感性较差，经改进的 AGID 免疫双扩散试验，不仅提高了敏感性，而且快速省时。SIV 的检测手段中，AGID 操作比较简单，结果容易判定，但其敏感性偏低。故将重组的 NP 蛋白进行纯化，将其作为检测抗原建立间接 ELISA 诊断试剂盒可提高其敏感性。国内已建立了 AGP 诊断技术及其诊断试剂盒。
3.4中和试验( SN)：
中和试验作为经典诊断方法在病毒鉴定中非常重要，很多新的检测方法都要以此为标准进行比较。用 SN 来鉴定或滴定 SIV 时，一般常选用对病毒敏感的组织培养细胞或鸡胚。SN 是较特异、敏感的血清学方法，但只有抗体与病毒上的表面抗原相对应，尤其 是与吸附到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应时才能取得确切的结果。中和试验在研究应用中较广泛，但其操作繁琐，费时间（一周左右），耗材料，故在实际临床诊断中不常使用。
3.5免疫过氧化酶单层细胞试验( IPMA)：
该技术用于检测猪血清中的 SIV 抗体。其特点是 特异性强，可检测出感染后 3 d 的抗体效价。本方法不需对待检血清血清进行处理，可同时检测两种亚型，更便于对猪群进行流感抗体的监测。
3.6免疫荧光法( IFA)：
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 IFA 的最大优点是稳定、敏感性和特异性高，值得推广应用。早在 1961 年就开始将 IFA 用于人类流感的快速诊断，此后又有很多研究人员用该方法检测流感病毒。用于猪流感诊断的方法，有直接荧光抗体法和间接荧光抗体法，但多用间接荧光抗体法。Onno 等用基于 NP 单克隆抗体的间接免疫荧光技术对试验感染猪鼻上皮细胞中的抗原进行检测，特异性荧光出现在感染细胞的细胞浆和细胞核内，结果表明该法与鸡胚分离病毒一样敏感，并且能在数小时内快速得到诊断结果。
3.7酶联免疫吸附试验( ELISA) ：
ELISA 是目前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术，已建立了多种方法，如间接法、双抗体夹心法、捕获法和生物素－ 亲和素法等。早在 1974 年就用于流感病毒的检测，因其敏感性高，特异性强，操作简便，肉眼可观察，便于大规模检测，适合于现场和基层使用，被认为是近代血清学上革命性的新成果。近年来，在传统 ELISA 方法的基础上，研究者们对其做了进一步改进。Swenson 等应用膜酶免疫试验和微孔膜免疫试验对流感病毒进行了检测;Voeten 等应用重组流感病毒核蛋白作为抗原包被 ELISA 板，对流感患者进行特异性 IgA 及 IgG 抗体检测，在感染后第 6 天，便可检测出特异性的 IgA，故其可以作为流感早期的血清学诊断方法之一。亢文华等建立了 PCR-ELISA 方法快速检测高致病性禽流感病毒。
3.8免疫组织化学( IHC) ：
免疫荧光技术和免疫组织化学试验的敏感性相近，但免疫组织化学试验能用于尸检时固定良好，并且送检过程中没丧失组织完整性的病料。SIV 感染后 3 d，肺部细胞感染的数量达到高峰，到第 5 天时许多病毒都已经排出。Kwonil 等也应用免疫组织化学试验对 H1N2 亚型猪流感进行了确诊，证实韩国 2005 年首次报道发生的 H1N2 亚型猪流感。
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