引起猪链球菌病的分子分类研究
李雪瑞 中国农业科学院
多年来，猪链球菌病一直以其致病菌的多样性，及导致生猪的高致死率而受到广大兽医的高度重视。截止到2010年，已报道的链球菌属有 65 个种，12 个亚种，同时，新的链球菌还不断从人，动物和环境中分离出来，并得到鉴定。
细菌在种的水平上进行分类的一个“黄金标准”，是利用 DNA-DNA 分子杂交技术测定 DNA 分子的相似度。基本方法是首先提取不同链球菌菌株的 DNA，然后加热变性解链，之后将两种变性的 DNA（其中一种为标记 DNA 或 rRNA）混合液在一定的温度下保温复性，重新得到杂交的双螺旋 DNA 分子，鉴定其双螺旋结合率。 DNA/DNA杂交时，同一猪链球菌菌株的结合率为 100%，同一种内或同一亚种细菌的结合率为 80%~90%，同一种内不同亚种的细菌的结合率为 60%~70%，同一属中的不同菌种间的结合率为 20%~60%。但该技术存在着许多缺陷，例如费时费钱，需要特殊设备和放射性同位素操作以及不容易对不同实验室的杂交结果进行比对等，因而需要较为简单的分子生物学方法来取代 DNA-DNA 分子杂交技术。
取代 DNA-DNA 分子杂交技术的一个较为理想的分子分型方法，是利用 16S RNA 序列进行分子分型。例如，1995 年，在 Yoshiaki 等人利用 16S rRNA 序列对 34 种（species）链球菌用领接法所做的系统分类学研究中，将这些链球菌分为 6 个群（Group），其中（草）绿色链球菌群（viridansgroup）分为 5 个群，分别为咽峡炎链球菌群（anginosus group），该群主要包括咽峡炎链球菌、星群链球菌星群亚种，星群链球菌咽炎亚种以及中间链球菌；缓征链球菌群（mitis group），该群主要包括缓征链球菌、血液链球菌、副血液链球菌、戈登链球菌、嵴链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、泛口腔链球菌以及婴儿链球菌；唾液链球菌群（salivarius group），包括唾液链球菌、前庭链球菌以及嗜热链球菌；牛链球菌群（ the bovis group ），包括牛链球菌，不解乳链球菌以及马肠链球菌；以及变异链球菌群（mutans group），包括变异链球菌、道恩链球菌、表兄链球菌、猕猴链球菌、仓鼠链球菌、鼠链球菌。此外，还有不属于（草）绿色链球菌群的化脓链球菌群（pyogenesgroup ），包括化脓链球菌、无乳链球菌、狗链球菌、豕链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等链球菌。在此研究中，猪链球菌和少酸链球菌既不属于化脓链球菌群，也不属于（草）绿色链球菌群，作为单个的种而单独存在。2009 年，在 Matthew 等人利用 16S rRNA 和RNase P RNA 基因连接合并，利用贝叶斯方法所做的无根数中，猪链球菌也是既不属于化脓链球菌群，也不属于（草）绿色链球菌群。该研究结果和其它的研究结果，为目前的教科书所采用。如伯杰氏系统细菌学手册第二版, 就采用了该研究成果。但利用 16 SRNA 序列分型也有其缺陷，一是由于该基因序列的保守性，难以对亲缘关系较近的链球菌在种的水平上准确分类，二是对一些链球菌的分型结果不准确。目前，多位点序列分型技术已用于同一属细菌的分群研究中，以克服这一缺陷。在链球菌就中，2005 年，Tomonori 等人利用四个看家基因，即 ddl，gdh，rpoB 和 sodA 的合并序列对链球菌分型，将链球菌分为两个大群。但该系统发育树由于存在一些缺陷，特别是在有关链球菌群与链球菌群关系的节点（node）处的是自举检验值偏低（bootstrapvalues），其分类结果有待进一步的确证。
为了使得有关链球菌分类的分类更为简便，目前已经有一些蛋白编码基因序列用于链球菌的分子生物学分类研究，这些研究中所使用的基因分别有编码 D-alanine : D-alanine 连接酶的 ddl 基因，编码自溶素的 lytA 基因，编码葡聚糖酶的 dex 基因，10 kDa 和 60 kDa 热激蛋白基因 groESL，内切核糖核酸酶基因 rnpB； recN 重组/修复蛋白），thdF (GTP-结合, 噻吩氧化) 和 RNA 聚合酶基因 rpoA，翻译延伸因子 Tu（tuf）, DNA 促旋酶基因喹诺酮抗性决定区域（gyrA）以及拓扑异构酶亚单位 C（parC），16S–23S rRNA 间隔区。根据这些研究结果，链球菌被分为不同的群。但在这些研究中，个别链球菌的分子分类结果则不一致，基因进化树的结果常常矛盾，难以准确判断哪种基因所做的系统进化树更有效。
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