外源营养依赖型猪链球菌的防疫机理
李雪瑞 中国农业科学院
众所周知，猪链球菌是畜牧养殖过程中极易遇到的、由多种链球菌引起的猪多种疾病的总称，引起该病的细菌品种极多，在自然界中分布广泛，极易呈地方性爆发。本文着重阐述外源营养依赖型猪链球菌的防疫机理，供各位兽医同行参考。
对该菌的生长试验表明，在没有外源 D-丙氨酸的条件下，基因灭活菌株不能正常生长，在添加有外源 D-丙氨酸的条件下，变异菌可正常生长，但其生长速度（繁殖一代所需的时间）只有猪链球菌 2 型正常菌群的 1/3 左右。说明本研究通过灭活猪链球菌 2 型 98HAH33 基因组上负责合成D-丙氨酸的 D-丙氨酸消旋酶，获得了必须依赖外源 D-丙氨酸才能生存的猪链球菌外源营养依赖型猪链球菌 2 型变异菌株。
在细菌体内，D-丙氨酸主要用于细菌细胞壁的合成，现有的研究表明，不同的细菌，其编码D-丙氨酸合成的酶不尽相同。细菌可能含有一或者两种丙氨酸消旋酶。如果细菌含有两种丙氨酸消旋酶基因，其中的一种属于组成型表达，其产物属于合成代谢，另一种属于诱导型表达，其产物用于分解代谢。它们表达的 D-丙氨酸对于细菌细胞壁的合成是必需的。目前，一些细菌基因灭活试验已经证实，在缺乏外源 D-丙氨酸的条件下，丙氨酸消旋酶对相关细菌的生长是必须的。在一些细菌，例如单核细胞增生利斯特菌，细菌还可以通过 D-氨基酸转氨酶来生成 D-丙氨酸。其它一些细菌，例如枯草杆菌，尽管也存在 D-氨基酸转氨酶，但 D-丙氨酸消旋酶对于细菌的生存也是必要的。本次研究也表明，D-丙氨酸消旋酶对猪链球菌 2 型菌株的生长是必须的。
研究发现，用基因敲除的方法灭活基因组上的特定基因时，由于该技术尚未完全成熟，其成功与否取决于诸多因素。本研究也发现，当敲除臂的长度在 400 至 500 个碱基时，会造成基因灭活的失败，而敲除臂的长度在 200 至 300 个碱基时，基因敲除的效果最好，该研究结果与 Thompson等人在李斯特菌中的研究结果一致。
目前，在一些研究中，通过对小鼠腹腔接种猪链球菌，进而观察其发病和死亡状况来确定细菌致病力的强弱。本研究通过对昆明小鼠腹腔接种不同剂量的猪链球菌正常菌株以及猪链球菌基因灭活菌株后发现，在 3.4×105剂量的强毒攻击下，用强毒株猪链球菌攻击的对照组小鼠有 7 只死亡，而用同等剂量的猪链球菌基因灭活菌株腹腔接种昆明小鼠后，小鼠没有表现出明显的临床症状。在用猪链球菌营养缺陷菌株腹腔接种昆明小鼠后，也没有小鼠表现出明显的临床症状，说明该菌的致病力减弱。本研究中的猪链球菌基因灭活菌株的致病力也减弱，其主要原因可能在于在小鼠体内，只有极其有限的 D-丙氨酸的存在，由此决定了猪链球菌基因灭活菌株在小鼠体内只能得到有限的生长，从而不能对小鼠造成感染。因此，我们推断，用该基因灭活菌株免疫小猪，应该是有安全保障的。最终，我们筛选到一株猪链球菌营养缺陷菌株作为试制疫苗所用菌株，而随后的实用免疫剂量测定结果、安全性试验以及免疫效力试验，均证实了用该菌株研制疫苗的可行性。
有关猪链球菌活疫苗的研究，由于受到多种因素的影响，结果也不一致。Holt 等用无毒菌株制作活疫苗，免疫猪后，免疫猪在受到强毒攻击时得到保护，但在扁桃体或关节里已经定居的猪链球菌 2 型菌株没有得到清除。Kebede 等用猪链球菌 2 型温度敏感缺失菌株作为疫苗免疫小鼠时，小鼠可以抵御不同型猪链球菌强毒株的攻击，但 Foster 等的结果与此不同，他们用一株猪链球菌 1/2 型突变株制作疫苗免疫动物，结果受免动物在受到同源菌株的攻击时得到保护，但对对猪链球菌 2 型强毒株的攻击只起到部分保护作用。 2007 年，Fittipaldi 等利用一株无毒、芳香族氨基酸营养缺陷型无荚膜菌株 BD101 作为活疫苗所做的研究显示，接种该疫苗后，尽管接种动物出现轻微的副反应，但不影响接种动物的生长。免疫动物产生良好的针对猪链球菌 2 型的抗体反应， 用 S735 强毒攻击后，免疫动物 100%存活。而未免疫动物 57%死亡。但在 Kock 等人2009所做的研究中，在对小猪免疫血清浑浊因子基因缺陷菌株 S. suis serotype 2 strain 10Deltaofs2/12后 3 周后，分别用猪链球菌 2 型和猪链球菌 9 型欧洲流行毒株攻击，尽管产生了体液免疫反应，但没有观察到明显的免疫效果。而在本研究中，免疫动物均产生了良好的体液免疫反应，同时也观察到比较满意的免疫效果。这可能与使用的毒株、佐剂等因素有关。据我们在多种细菌和病毒疫苗研制过程中得到的经验，就是疫苗必须含有足够的抗原成分，而合适的疫苗佐剂，能够有效而大幅度提高疫苗的免疫效果。本研究经过比较多种疫苗佐剂的使用效果后，最终确定使用 305 纳米佐剂。由于 305 纳米佐剂具有控释、缓释作用，使得基因缺陷株链球菌能够缓慢地释放到机体中，持续而有效地刺激机体产生免疫反应，提高了疫苗的免疫效力。在后续的研究中，我们将测定该疫苗能否对同型其它菌株以及其它致病型的链球菌攻击产生有效的保护性免疫
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