２．４　基因工程致弱毒株

     通过基因工程技术可精确地将ＡＰＥＣ中参与代谢或致病基因敲除而制备疫苗是目前疫苗研究的新领域。Ｋｗａｇａ等［３０］将ＡＰＥＣ　Ｏ２菌株编码精氨酸和嘧啶代谢作用的酶基因ｃａｒＡＢ敲除制备突变株弱毒疫苗，将此突变株（５×１０４和７×１０５　ＣＦＵ）皮下接种１日龄雏鸡证明安全。口服免疫４周龄火鸡后１周，可抵抗出血性肠炎病毒Ａ和Ｏ２野生菌株的联合气管攻毒。免疫火鸡未观察到任何病变，而未免疫火鸡攻毒后的死亡率和病变率分别为４０％和５２％，但此疫苗对异源菌株攻毒或肉鸡使用效果如何未见后续报道。

   

  

     Ｐｅｉｇｈａｍｂａｒｉ等［３１］通过类似的途径构建了ＡＰＥＣ　Ｏ２和Ｏ７８△ｃｙａ△ｃｒｐ突变株。通过单剂量和双剂量喷雾免疫肉仔鸡以确定其安全性、免疫原性和效力。通过对１４和２１日龄肉仔鸡喷雾２０μｍ液滴野生型大肠杆菌、突变株（△ｃｙａ△ｃｒｐ）或磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）确定疫苗的安全性和免疫原性。Ｏ２和Ｏ７８突变株免疫接种鸡不引起死亡或肉眼病变。接种突变株和野生菌株的肉鸡血清ＩｇＧ和气囊洗液ＩｇＡ水平显著高于ＰＢＳ对照组。用Ｏ　２或７８疫苗株免疫１４ｄ和用Ｏ２疫苗株免疫１０和１４ｄ的肉仔鸡，免疫后１０ｄ用原始毒株攻毒。结果免疫组和对照组之间局部ＩｇＡ和ＩｇＧ，血清ＩｇＧ应答无显著差异。用Ｏ２而非Ｏ７８疫苗株免疫的雏鸡气囊损伤等级显著低于未免疫组。通过精准缺失突变技术，Ｋａｒｉｙａｗａｓａｍ等［３２］构建了３种生物合成基因突变株，即ｇａｌＥ（编码ＬＰＳ合成所需的尿嘧啶核苷二磷酸盐半乳糖差向异构酶）、ｐｕｒＡ（编码嘌呤生物合成所需的腺苷酸琥珀酸合成酶）及ａｒｏＡ基因（编码对氨基苯甲酸、芳香族氨基酸和叶酸生物合成的中间产物－分支酸）。用此３株突变株气雾免疫１和１４日龄的雏鸡表明安全、无毒并能保护同源菌株气雾攻毒，但对异源菌株攻毒无效，其中△ｐｕｒＡ株不及其他两株有效。Ｓａｌｅｈｉ等［３３］也证实△ａｒｏＡ突变株Ｏ７８∶Ｋ８０免疫１和１４日龄雏鸡不能产生抗体应答，对同源和异源菌株攻毒无效并导致试验鸡气囊、肝脏和心包的病理变化，且免疫的肉鸡与对照组相比体重减轻。新近的研究表明疫苗是通过细胞介导免疫而非循环抗体获得保护［３４］。

     此外，Ｎａｇａｎｏ等［３５］通过等位基因交换构建了ｃｒｐ基因缺失疫苗，该疫苗株失去了色氨酸脱氨酶活性、缺乏吸附刚果红的能力、不能发酵除葡萄糖和Ｌ－果胶糖以外的糖类，亦不携带４种已知的毒力基因（ｉｓｓ、ｔｓｈ、ｃｖａＡ、ｐａｐＣ）。通过喷雾和点眼及胚内接种可激发对野生毒力型ＡＰＥＣ　Ｏ７８攻毒的有效免疫应答。特别是经此疫苗免疫后，通过静脉攻毒，与对照组相比，死亡率、临床和器官损伤等级及攻毒菌株回收率均降低。其优点是接种１９日龄的鸡胚，其出雏率及雏鸡存活率不受影响，虽然自免疫雏鸡回收到了少量的攻毒菌株。这种接种途径对家禽业逐渐广泛使用的胚胎免疫具有更大价值。

     令人不可思议的是很多在试验条件下证明安全有效的ＡＰＥＣ弱毒疫苗株为何没有商品化？其原因除存在非特异性突变和毒力返强的可能外，或许与其“毒力太弱”以至于不能在体内存活足够长的时间以激发坚强的免疫应答有关。即使已商品化的疫苗ＰｏｕｌＶａｃ仍需进一步在田间条件下观察。然而，与必须进行个体免疫的灭活疫苗相比，弱毒疫苗更适用于现代规模化养殖场群体免疫的需求，这或许是吸引众多研究者深入研发此类疫苗的关键所在。目前研发的ＡＰＥＣ活疫苗见表２［２２］。

     抗菌毛抗体可阻止ＡＰＥＣ黏附宿主细胞表面［３６］。据此，Ｇｙｉｍａｈ等［３７］研发并试验了鸡大肠杆菌病的Ｏ１∶Ｋ１菌毛油乳剂疫苗。疫苗含菌毛蛋白１１６或２９μｇ，分别在４和６周龄皮下注射２次。８周龄时后胸气囊内注射同源ＡＰＥＣ攻毒。与未免疫对照鸡相比，免疫鸡死亡率、病变损伤程度及内脏细菌回收率显著下降。随后，该组作者又研发了包括３种最常见血清型（Ｏ１、Ｏ２和Ｏ７８）在内的多价菌毛疫苗，每种血清型菌毛蛋白为１８０μｇ［３８］。该疫苗经皮下接种４和６周龄鸡，２周后攻毒，与对照鸡相比，免疫鸡对Ｏ１、Ｏ２和Ｏ７８菌株所致的损伤等级显著降低。

     ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｏｓｃｈ［３９］研究了自鸡大肠杆菌病分离并于琼脂培养基上生长的ＡＰＥＣ菌株Ｆ１１菌毛的表达。对大量收集的菌株筛查结果表明所有检测的ＡＰＥＣ，７８％的菌株及属于禽大肠杆菌病中最常见的血清型（Ｏ１∶Ｋ１、Ｏ２∶Ｋ１、Ｏ３５和Ｏ７８∶Ｋ８０）的９６％ＡＰＥＣ菌株均表达Ｆ１１菌毛。Ｆ１１菌毛用于免疫肉种母鸡，其抗体应答通过ＥＬＩＳＡ检测。免疫母鸡孵出的仔鸡于３周龄用Ｏ１∶Ｋ１、Ｏ２∶Ｋ１、Ｏ１５∶Ｋ１４、Ｏ３５∶Ｋ－或Ｏ７８∶Ｋ８０ＡＰＥＣ气囊内攻毒，结果高达８５％的雏鸡获得保护。用静脉接种制备的Ｆ１１家兔抗血清静脉被动免疫接种３周龄肉仔鸡，随后气囊内注射同源或异源ＡＰＥＣ攻毒。除Ｏ１∶Ｋ１外，雏鸡对其他所有血清型都获得保护。

     Ｋａｒｉｙａｗａｓａｍ等［４０］用ＰａｐＧ或ＦｉｍＨ菌毛黏附素免疫肉鸡纯化的ＩｇＹ肌肉注射１１日龄肉仔鸡，３ｄ后免疫鸡用同源Ｏ７８ＡＰＥＣ（纯化菌毛蛋白用菌株）或异源ＡＰＥＣ（Ｏ１和Ｏ２）气囊内攻毒以评估被动接种菌毛黏附素抗体的效力。接种抗ＰａｐＧ　ＩｇＹ的雏鸡对同源和异源ＡＰＥＣ攻毒获得保护，而接种抗ＦｉｍＨ　ＩｇＹ的雏鸡对同源和异源ＡＰＥＣ攻毒不能保护。Ｖａｎｄｅｍａｅｌｅ等［４１］将ＰａｐＧⅡ等位片段肌注１０日龄雏鸡后可诱发强烈的体液ＩｇＹ应答。２４ｄ后，用２．７×１０９　ＣＦＵ／ｍＬ培养物气囊或喷雾攻毒，其保护与非免疫对照组比较无显著差异。由于未对呼吸道黏膜表面ＩｇＡ进行检测，故很难得出ＰａｐＧ等位片段无保护的结论，因为非正统的投给方法却可诱导产生黏膜免疫。

     ３．２　荚膜多糖

     细菌的荚膜多糖能抵抗巨噬细胞的吞噬作用，从而影响其他表面抗原的免疫应答。故可利用荚膜多糖制备亚单位疫苗免疫鸡，产生抗体以消除其抗吞噬作用，达到防御大肠杆菌侵袭的目的。虽然国内外均有报道，终因其制备成本高、效果一般，故实际应用价值不大。

    

     用家兔抗大肠杆菌Ｏ１１１　７３ｋｕ铁肠杆菌素受体蛋白的多克隆抗血清筛检的１７株致病性和非致病性大肠杆菌中，发现肠菌素（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）受体的分子质量和抗原特性高度保守［４２］。这种特性使得肠菌素受体或其他ＩＲＯＭＰｓ可作为潜在的ＡＰＥＣ候选疫苗株。用家兔制备的抗ＩＲＯＭＰｓ（自大肠杆菌Ｏ７８∶Ｋ８０∶Ｈ９提取）血清静脉接种被动免疫１８日龄火鸡，２ｈ后，腹气囊接种同源大肠杆菌（１×１０６或２×１０６　ＣＦＵ）攻毒，接种火鸡获得保护，无死亡率，而注射正常家兔血清和生理盐水的对照组死亡率为１６％［４３］。此外，免疫组于攻毒后９６ｈ的菌血症降低，气囊回收大肠杆菌减少及攻毒火鸡肉眼病变程度减轻。气菌素（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）是肠杆菌科产气菌素细菌产生的一种铁载体。Ｌｅ　Ｒｏｙ等［４４］用铁气菌素联合福氏完全佐剂间隔７ｄ免疫种母鸡，采用ＥＬＩＳＡ方法检测出壳雏鸡的抗铁气菌素特异性抗体是否转移。出壳后立即用１０倍系列稀释强毒力产气菌素大肠杆菌Ｏ７８菌株的过夜培养物攻毒，未见明显保护。虽然母鸡产生的抗体不能保护其子代，但试验再次表明免疫母鸡可能是对付ＡＰＥＣ的一种切实可行的策略，因为特异抗体显著经卵沉积。Ｅｍｅｒｙ等［４５］从在铁限制条件下培养增殖的大肠杆菌Ｏ７８分离株提取了４种铁载体受体蛋白（ＳＲＰｓ）并用其免疫火鸡。每羽含２５０μｇ　ＳＲＰｓ的油包水佐剂经皮下免疫接种２１和３８日龄的火鸡。为观察是否有交叉保护潜力，用沙门氏菌静脉攻毒，结果火鸡抵抗。通过ＥＬＩＳＡ、血清凝集和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验证明抗ＳＲＰｓ的高免血清抗体升高，且可与除大肠杆菌以外的沙门氏菌、巴氏杆菌、假单胞菌及克雷伯氏菌菌株反应。用这种疫苗经皮下免疫接种３周龄的火鸡改变了农场大肠杆菌病的病史。与以前农场的记录相比，接种疫苗的火鸡除增加了屠宰时的平均体重外，也降低了死亡率和加工时的废弃率。另一项研究也表明抗气菌素外膜蛋白受体（ＩｕｔＡ）的抗体能提供对肉仔鸡ＡＰＥＣ引起的呼吸道／败血症的保护［４６］。用此蛋白免疫产蛋鸡，１１日龄仔鸡肌肉注射自免疫母鸡所产蛋纯化的ＩｇＹ。被动免疫３ｄ后的仔鸡可抵抗气囊内接种同源（用于制苗的Ｏ７８大肠杆菌）和异源（Ｏ１和Ｏ２）菌株的攻毒。