禽大肠杆菌病（ａｖｉａｎ　ｃｏｌｉｂａｃｉｌｏｓｉｓ，ＡＣ）是由禽致病性大肠杆菌（ａｖｉａｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ－ｌｉ，ＡＰＥＣ）引起鸡、火鸡及其他禽类急性、全身性肠外感染的总称，临床上以心包炎、肝周炎、气囊炎、蜂窝织炎、败血症及输卵管炎、腹膜炎、雏鸡脐炎和肿头综合征等较为常见，是目前导致世界养禽业特别是肉鸡业经济损失最为严重的细菌性传染病。感染ＡＰＥＣ的禽群死亡率增高、胴体废弃率增加、生长率及饲料转化率下降，有研究结果表明，ＡＰＥＣ与其他肠外致病性大肠杆菌（ＥｘＰＥＣ）如新生儿脑膜炎大肠杆菌（ＮＭＥＣ）及尿道致病性大肠杆菌（ＵＰＥＣ）具有相似的毒力基因及致病能力，是重要的食源性人畜共患病原菌［１－２］。此外，ＡＰＥＣ亦是通过其携带质粒和遗传物质交换而传播耐药基因的主要来源［３］。多年的生产实践表明，通过消除易感因素或通过药物防控禽大肠杆菌病效果甚微，且随着耐药菌株不断产生及药物残留问题的增加，禽产品质量安全愈来愈受到人们的重视。因此，利用非抗生素方法防控ＡＰＥＣ将是未来发展的必然趋势，其中接种疫苗是有效防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全的重要途径［４］。

     目前根据疫苗的抗原组分及制苗方法，预防禽大肠杆菌病的疫苗可分为灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、广谱疫苗及未来疫苗５类。作者将对这５类疫苗进行简要阐述，以期为禽大肠杆菌病的防控提供参考。

     大肠杆菌灭活疫苗可通过福尔马林、乙醇、丙酮、加热、超声波裂解及辐射等理化方法灭活制备。１９５７年，Ｇｒｏｓｓ［５］率先使用福尔马林灭活ＡＰＥＣＯ２∶Ｋ１和Ｏ７８∶Ｋ８０免疫接种肉仔鸡，然后用Ｏ２或Ｏ７８菌株进行攻毒以评估疫苗对同源和异源菌株的保护效力。结果发现Ｏ７８对同源菌株（Ｏ７８）比对异源菌株（Ｏ２）攻毒有更好的保护力，而用Ｏ２疫苗免疫的仔鸡对２种血清型攻毒菌株无保护力［５］。随后，Ｄｅｂ等［６－７］分别通过乙醇、丙酮、福尔马林、加热灭活及福尔马林灭活／明矾沉淀方法对Ｏ７８∶Ｋ８０大肠杆菌制备疫苗，经皮下、肌肉和腹腔内接种３周龄肉仔鸡，结果发现福尔马林灭活／明矾沉淀疫苗组可抵抗同源菌株肌肉攻毒至６周龄。同样，与Ｏ７８∶Ｋ８０疫苗相比，用ＡＰＥＣ１５３株Ｏ２∶Ｋ１制备的疫苗免疫仔鸡，尽管能诱导产生高滴度的Ｏ和Ｋ凝集素，但对同源菌株攻毒缺乏保护。因此，只通过对Ｏ和Ｋ抗原的抗体应答并不能确定ＡＰＥＣ疫苗的效力，因为在相同的抗原（Ｏ２∶Ｋ１）中加入弗氏完全或不完全佐剂后皮下接种２～３周龄的仔鸡则可获得保护。相关的研究也证实福尔马林灭活的Ｏ１∶Ｋ１油佐剂疫苗经皮下接种４和６周龄或５和７周龄鸡，２周后用３×１０６　ＣＦＵ的ＡＰＥＣ气囊攻毒，结果只对同源菌株保护［８－９］。鉴于此，Ｓｃｈｗａｒｔｚ等［１０］制备了多价（Ｏ１、Ｏ２和Ｏ７８）油乳剂疫苗分别于１和１４日龄２次肌肉接种仔鸡后，对３种血清型菌株攻毒均可产生明显的保护，但对异源ＡＰＥＣ菌株攻毒无效，故ＡＰＥＣ疫苗缺乏通用性。

     虽然灭活疫苗只对同源菌株提供保护，但攻毒途径及灭活方法亦会影响试验结果。如用加热或福尔马林灭活的Ｏ７８∶Ｋ８０∶Ｈ９肌肉免疫１和２周龄的火鸡，１０ｄ后用同源菌株静脉攻毒，结果全部免疫火鸡均出现ＡＰＥＣ感染病变［１１］。Ｍｅｌａｍｅｄ等［１２］通过超声灭活Ｏ２∶Ｋ１和Ｏ７８∶Ｋ８０大肠杆菌并加入氢氧化铝佐剂制备疫苗，皮下接种１０日龄雏鸡，１０ｄ后用同源和异源菌株皮下攻毒，通过死亡鸡数和出现ＡＰＥＣ病变鸡数确定保护效果，结果表明Ｏ２∶Ｋ１疫苗对同源（Ｏ２∶Ｋ１）和异源（Ｏ７８∶Ｋ８０）菌株攻毒提供保护，而Ｏ７８∶Ｋ８０疫苗对异源（Ｏ２∶Ｋ１）菌株攻毒无保护。经超声灭活的疫苗，其保护效果也优于加热、福尔马林或辐射处理灭活的疫苗，其保护程度与攻毒时ＥＬＩＳＡ检测的抗体滴度呈正相关。进一步将超声灭活的Ｏ２∶Ｋ１制备膜泡（ｍｅｍ－ｂｒａｎｅ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）疫苗免疫火鸡，则可获得对同源菌株攻毒保护。此种疫苗不仅产生ＥＬＩＳＡ抗体，同时也刺激补体系统和细胞毒性Ｔ细胞的杀菌活性［１３］。大肠杆菌Ｊ５是一株遗传稳定、粗糙型突变株，缺乏尿苷二磷酸半乳糖－４－差向异构酶（ＵＤＰ－半乳糖－４－差向异构酶，催化菌体侧链连接核心抗原的酶），对雏鸡及鸡胚无致病性［１４－１５］。将其８０℃水浴加热灭活１ｈ（６×１０８　ＣＦＵ／ｍＬ），分别静脉接种５、１４和２０日龄肉仔鸡各０．２５、０．５和１ｍＬ，２８日龄静脉攻毒Ｏ７８菌株（６×１０８　ＣＦＵ／ｍＬ）后连续观察７ｄ。结果表明接种灭活Ｊ５的仔鸡全部健活，剖检亦无肉眼可见病变，其所产生的血清抗体与Ｏ７８具有交叉反应，这可能与Ｊ５细胞壁侧链不完整而使核心抗原簇暴露有关。事实上，所有血清型大肠杆菌的核心抗原在化学结构及免疫学上都相似，这为开发广谱大肠杆菌灭活疫苗指明了方向［１６］。

     由于ＡＰＥＣ灭活疫苗通常需要注射接种，同时鉴于母源抗体可传递给子代，故免疫种鸡即可使仔鸡获得被动保护，克服了规模化鸡场单个注射接种仔鸡的弊端。１９８５年，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ等［１７］首次用福尔马林灭活的Ｏ２、Ｏ７８和Ｏ３５ＡＰＥＣ备油乳剂疫苗于２０周龄１次或２０和２５周龄２次免疫种母鸡，微量凝集试验检测表明被免种鸡的特异抗体升高。对被免和未免种鸡孵出的仔鸡气管攻毒同源菌株表明母源抗体可保护仔鸡减少出壳后死亡率和损伤长达２周。Ｃｈａｆｆｅｒ等［１８］亦观察到火鸡抗ＡＰＥＣ的母源抗体出壳时滴度高，其后逐渐下降至１４日龄低滴度。种鸡亦获得了类似结果，即出壳后仔鸡至２１日龄时检测不到ＡＰＥＣ抗体［１３］。尽管如此，但出壳２１ｄ后的仔鸡／火鸡必须获得保护，因为此日龄段是易感ＡＰＥＣ的高峰期［１９］。

     １．２　生物方法灭活疫苗（菌蜕疫苗）

     菌蜕（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｈｏｓｔｓ，ＢＧｓ）作为新型基因灭活苗，具有与活菌形态结构一致，但无活菌的致病作用并可诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫。据Ｊａｌａｖａ等［２０］介绍用制备的大肠杆菌Ｏ７８∶Ｋ８０菌蜕经口服、肌肉注射和滴鼻免疫１日龄雏鸡，免疫后２１ｄ用同源菌株攻毒。尽管全部免疫接种鸡发病，但肌肉和口服免疫组的死亡率明显降低，自心脏和肝脏回收攻毒菌株也明显减少，而滴鼻免疫组的死亡率与对照组相同。因此，１日龄雏鸡口服大肠杆菌Ｏ７８∶Ｋ８０菌蜕疫苗优势明显。Ｍａｙｒ等［２１］用不添加任何佐剂的肠出血性大肠杆菌（Ｏ１５７∶Ｈ７）菌蜕疫苗单次口服免疫小鼠，可诱导产生细胞与体液免疫。免疫小鼠后第５５天用异源肠出血性大肠杆菌进行致死性攻毒，其免疫保护率为８６％；如于２８ｄ进行第２次加强免疫，则小鼠的免疫保护率可高达９３．３％，而对照组存活的小鼠分别为２６．７％和３０．０％。因此，利用单剂量大肠杆菌菌蜕疫苗免疫的动物可获得良好的免疫保护，其交叉免疫保护效果也优于其他疫苗。

     综上所述，灭活疫苗的效力不仅与制苗用ＡＰＥＣ菌株血清型、佐剂类型、制苗方法及接种途径和次数有关，同时还受免疫鸡日龄的影响。目前研发的ＡＰＥＣ灭活疫苗见表１［２２］。

     最早使用的禽大肠杆菌病弱毒疫苗为活的无毒株或致弱毒株。１９８０年，Ａｒｐ［１１］用ＡＰＥＣ　Ｏ７８∶Ｋ１活疫苗肌肉或气管滴入免疫７和１４日龄火鸡，２４日龄时用１０８　ＣＦＵ同源菌株静脉攻毒，与未免疫组比较，气管接种组的死亡率降低了８８％、肌肉接种组降低了７７％。虽然免疫组降低了死亡率，但攻毒后２～４ｄ存活的多数火鸡表现有败血性多滑膜炎。１９９４年，Ｆｒｏｍｍｅｒ等［２３－２４］用一株分离自肉仔鸡粪便的活的含菌毛非致病性菌株ＢＴ－７（血清型Ｏ６４）分别对于１、７、１４和２１日龄肌肉免疫的肉鸡，２８日龄攻毒，结果发现１４或２１日龄免疫较１或７日龄免疫的仔鸡保护更坚强，其原因可能是由于母源抗体干扰和／或免疫器官不成熟而对抗原刺激不能产生有效的免疫应答。经不同途径（肌肉、喷雾、饮水）和接种次数（１或２次）免疫肉仔鸡，结果表明，２１日龄免疫后１周肌肉攻毒Ｏ１∶Ｋ１、Ｏ２∶Ｋ１和Ｏ７８∶Ｋ８０至少保护２周。在７和２１日龄经饮水或肌肉途径２次免疫的仔鸡与在２１日龄经相同途径１次免疫的仔鸡，其保护率相当，而喷雾免疫的仔鸡缺乏明显的保护［２４］。

     １９８５年，Ｎｉｖａｓ等［２５］将吖啶橙处理过的一种光滑型耐链霉素Ｏ７８菌株作为疫苗（２４ｈ肉汤培养物）气雾免疫事先暴露于氨气和不暴露氨气的２周龄火鸡，结果表明未暴露氨气组的火鸡可有效清除肺脏和其他内脏的细菌，而暴露于氨气组的火鸡与对照组相比无显著差别。同年，Ｎａｖｅｈ等［２６］利用亚硝酸增殖含有ＬＰＳ核心（ＬＰＳ核心为多数肠道致病菌共有，其抗体可提供广谱保护）但不能生物合成Ｏ抗原多糖的大肠杆菌Ｋ－１２粗糙型突变株（ＬＲ－２），将此突变株给鸡接种１０８　ＣＦＵ亦无毒力，但接种鸡可通过激活巨噬细胞和吞噬细胞诱导产生非特异性免疫。此疫苗可经气雾和饮水及喷雾等不同方法进行群体免疫。用单剂量免疫５～３５日龄的雏鸡，可对Ｏ２和Ｏ７８气管攻毒提供保护达２０ｄ。

     黄青云等［２７－２８］选取常见的Ｏ２和Ｏ７８ＡＰＥＣ菌株，分别以氟哌酸和氯霉素诱导，培育成遗传性稳定的耐药标记弱毒菌株Ｏ２（Ｎｏｒｒ，Ｃｈｌ　ｓ）和Ｏ７８（Ｃｈｌ　ｒ，Ｎｏｒｓ），进一步以其作亲本，通过原生质体融合技术培育成功具有双抗药性和双抗原性的融合双价弱毒菌株Ｏ２／Ｏ７８（Ｎｏｒｒ　Ｃｈｌ　ｒ），通过ＡＡ鸡安全试验及免疫试验证明其安全，免疫原性优良。提取其外膜蛋白（ＯＭＰｓ）分别免疫小鼠和鸡均产生对Ｏ２和Ｏ７８良好的同源及异源交叉保护，为研究通用安全的ＡＰＥＣ　ＯＭＰｓ疫苗提供了科学依据［２９］。

（河北工程大学农学院分子生物学实验室，马兴树)