产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起新生仔猪大肠杆菌病的主要病原，特别是出生后4～5d的仔猪黄痢和2～3周后仔猪白痢。ETEC主要通过F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)或F41黏附素与肠上皮细胞上特异性受体结合，产生耐热肠毒素(ST1，ST2)和不耐热肠毒素(LT1)，引起腹泻［1－2］。

     毒力岛(pathogenicityisland)是细菌染色体上编码毒力相关的特殊区域，是某些细菌在进化过程中适应环境的变化而获得的毒力基因HPI毒力岛最早发现于耶尔森菌，因与该属菌的小鼠致死表型密切相关，故被命名为强毒力岛(highpathogenicityisland，HPI)［3－4］。HPI在耶尔森菌属中首先发现，包括小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌。小肠结肠炎耶尔森菌的HPI为45kb，其主要的结构基因为irp2，irp1和fyuA，irp2和irp1编码铁摄取相关蛋白，fyuA编码鼠疫菌素受体［5］。自1998年Schu-bert等［6］首次报道了某些致病性大肠杆菌中携带HPI基因簇以来，陆续有研究表明HPI在肠杆菌科细菌中广泛分布，如在枸橼酸杆菌、克雷伯菌和沙门菌等均有一定比例的检出率，尤其是在各种大肠杆菌的分离株中［7－10］。研究表明，大肠杆菌与鼠疫耶尔森氏菌的HPI在核苷酸水平上有99%的相似性，这说明HPI在肠杆菌科细菌中可能发生水平转移。当前，国内外有很多关于ETEC和HPI+大肠杆菌在断奶仔猪腹泻中作用的报道［11－14］，对于ETEC和HPI+大肠杆菌的分子流行病学检测方法也层出不穷。相反，对于新生仔猪腹泻主要毒力因子的快速检测和流行病学资料却寥寥无几。为研究ETEC和HPI+大肠杆菌在新生仔猪腹泻中的作用和地位，本研究建立了一种直接从粪便培养物中检测毒力因子的多重PCＲ和单重PCＲ方法，研究了菌毛、毒素、HPI在新生仔猪源大肠杆菌中的携带情况。

2006—2008年从江苏部分地区采集临床上疑似新生仔猪腹泻粪便110份，同时采集同年龄段的临床健康新生仔猪粪便35份，收集的直肠棉拭样品悬浮于含有0.85%NaCl的灭菌离心管中，于4℃保存。参考菌株S17/YC(ST1+/ST2+/LT1+)、C83912、C83710(ST1+)、C83600(ST2+/LT1+/K88ac+)、C83912(K99+)、C83710(987P+)、C83260(F41+)、S790725(HPI+)、S790726(HPI+)均为扬州大学兽医微生物实验室保存。

     1.2引物

     在GenBank中已发表的大肠杆菌毒素、菌毛、毒力岛基因序列分析比较的基础上，参照文献［15］分别设计ST1、ST2、LT1、K88、K99、987P、F41和irp2等7对特异性引物，预期扩增出的目的片段大小分别为183、360、282、841、543、463、682和280bp。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，浓度均为50mmol/L。引物序列见表1。

    

     1.3试剂

     PCＲ试剂盒(包括TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCＲbuffer(Mg2+Free)、MgCl2)、10×loadingbuff-er、DL－2000Marker均购自大连宝生物工程有限公司。优质琼脂糖购自上海生物工程服务有限公司。

     1.4培养基

     LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，加蒸馏水1000mL，pH7.2)，由本实验室配制。麦康凯琼脂(Mackonkeyagar，蛋白胨20g，乳糖10g，NaCl5g，牛胆盐5g，中性红0.025g，琼麦康凯脂粉20g，加蒸馏水1000mL，pH(7.3±0.2))购自上海国药集团化学试剂有限公司。

     1.5主要仪器

   

     PCＲ扩增仪(MiniCyclerTM，美国MJＲE-SEＲAＲCH公司);电泳仪(DYY10C型，北京市六一仪器厂)。

     1.6病料采集及增菌培养

     取高压灭菌后的棉签轻轻插入腹泻仔猪直肠，沾取直肠内容物并稀释于0.6mL灭菌的生理盐水中，后取病料稀释液100μL接种于LB液体培养基中，在培养箱中37℃无氧增菌培养24h。

     1.7DNA模板的制备

     取上述增菌培养物及参考菌株，采用煮沸法分别制备DNA模板。方法如下:对于增菌培养物取1mL，12000r/min离心5min，去上清;加入1mL生理盐水，反复吹打使重悬，离心，去上清(同上)。加入100μL超纯水，混匀。100℃煮沸10min，然后迅速0℃冰浴5min，最后，4℃10000r/min离心10min。取上清，即为DNA模板。对于参考菌株取单个菌落，均匀悬浮于50μL超纯水中，其他方法同上。DNA模板置4℃备用。

     1.8毒素基因的多重PCＲ方法检测

     取10×PCＲBuffer(Mg2+)5μL、dNTPMixture(浓度均为2.5mmol/L)5μL、引物混合物ST1、ST2、LT1(浓度均为50mmol/L)3μL、TaqDNA聚合酶1μL(5U)、DNA模板2μL，加水至50μL。PCＲ反应条件:94℃3min，94℃0.5min，60℃0.5min，72℃1min，每2个循环降低1℃，共8个循环。然后94℃0.5min，56℃0.5min，72℃1min，72℃10min，共24个循环，4℃保存。

     1.9菌毛基因的多重PCＲ检测

     取10×PCＲBuffer(Mg2+)5μL、dNTPMixture(浓度均为2.5mmol/L)5μL、引物混合物K88、K99、987P、F41(浓度均为50mmol/L)4μL、TaqDNA聚合酶1μL(5U)、DNA模板2μL，加水至50μL。PCＲ反应条件:94℃3min，94℃0.5min，56℃0.5min，72℃1min，每2个循环降低1℃，共8个循环;然后94℃0.5min，52℃0.5min，72℃1min，72℃10min，共24个循环，4℃保存。

     1.10HPI毒力岛核心区基因irp2的检测

     取10×PCＲBuffer(Mg2+)5μL、dNTPMixture(2.5mmol/L)5μL、引物混合物irp2(50mmol/L)1μL、TaqDNA聚合酶1μL(5U)、DNA模板2μL，加水至50μL。PCＲ反应条件:94℃3min，94℃0.5min，64℃0.5min，72℃1min，每2个循环降低1℃，共8个循环。然后94℃0.5min，58℃0.5min，72℃1min，72℃10min，共24个循环，4℃保存。

     1.11PCＲ产物琼脂糖凝胶电泳

     取PCＲ扩增产物10μL在1%琼脂糖凝胶中进行100V电泳40min。以DNAMarkerDL2000为参照，观察扩增片段的大小。

     1.12临床样品的快速检测

     取来自江苏部分地区以直肠棉棒采集临床疑似大肠杆菌感染的新生仔猪腹泻样品110份和健康新生仔猪粪便35份，按照1.7制备的DNA模板，分别按步骤1.8、1.9、1.10、1.11进行PCＲ检测和凝胶电泳，以确定毒素、菌毛、毒力岛在新生仔猪源大肠杆菌的分布情况。

     以3对引物ST1、ST2、LT1(浓度均为50mmol/L)混合，以标准DNA为模板进行多重PCＲ扩增，结果从携带ST2、LT1、ST1大肠杆菌S17/YC株能扩增到预期约360、282和183bp的片段，从携带ST2和LT1大肠杆菌C83600株可扩增到预期约360bp和282bp的片段，均与预期大小一致(图1)。这表明该PCＲ方法能够特异性鉴ETEC。

    

     2.2多重PCＲ检测菌毛基因的特异性

     以4对引物K88、K99、987P、F41(浓度均为50mmol/L)混合，以K88+、K99+、987P+、F41+，大肠杆菌混合DNA为模板进行多重PCＲ扩增，结果从标准菌株C83600(ST2+/LT1+/K88ac+)、C83912(K99+)、C83710(987P+)、C83260(F41+)分别扩增到841、543、463和682bp特异性片段，与预期大小一致(图2);而从其他菌株均不能扩增到预期片段。表明用混合引物建立的多重PCＲ可用于K88+、K99+、987P+、F41+大肠杆菌菌毛类型的鉴定。

    

     2.3PCＲ检测HPI毒力岛核心区基因的特异性

     以引物irp2建立的PCＲ，可从S790725(HPI+)和S790726(HPI+)标准菌株扩增到预期约280bp的片段，与预期大小一致(图3);而从其他菌株均不能扩增到期望的片段。这表明该PCＲ方法能够特异性鉴定HPI毒力岛核心区基因。

   

     2.4临床样品毒素、菌毛、毒力岛基因的快速检测

     对临床110份新生仔猪腹泻样品快速检测表明，编码高分子量蛋白质的基因irp2是最常见的毒力因子，占所检测样品的58.18%，其次是LT110.91%(12/110)、ST28.18%(9/110)、987P6.36%(7/110)、K883.64%(4/110)、ST12.73%(3/110)、K990.91%(1/110)。在所检测的7种毒力因子中，没有检测出菌毛基因F41。通过比较还发现，致新生仔猪腹泻的大肠杆菌中，只携带HPI毒力岛的大肠杆菌占50%，ETEC占6.37%，ETEC并发HPI感染的占8.18%(图4)。

      

     对临床35份同年龄段的健康仔猪样品快速检测表明，编码高分子量蛋白质的基因irp2也有很高的检出率，占42.86%(15/35)，ST2也有5.71%(2/35)的检出率。然而未检出ST1、LT1、K88、K99、987P、F41基因。比较还发现，健康新生仔猪的大肠杆菌中，只携带HPI毒力岛的大肠杆菌占45.71%，ETEC占2.85%，ETEC并发HPI感染的占0%(图5)。

    

     本研究通过对病料增菌后直接用于PCＲ检测，不但可快速确定是否存在感染，而且具有检测时间短、特异性强、检出率高等优点，这为临床活体病例的诊断开辟了新途径。通过建立的多重PCＲ和PCＲ方法对江苏部分地区新生仔猪腹泻粪便样品进行直接增菌后快速检测，结果表明，ETEC仍是导致新生仔猪腹泻的主要病原之一，能检测到样品至少携带ST2、LT1、ST1中的一个毒力因子，其携带率依次是LT1(10.91%)、ST2(28.18%)、ST1(2.73%)。Jin等［16］报道74%ETEC携带ST2，其中33%致新生仔猪腹泻的ETEC中携带ST2，这与本研究报道略有不同。在国内，陈祥等［17］2004年报道致仔猪黄、白痢大肠杆菌黏附素的阳性率为28.61%，与我们调查的黏附素阳性率略有不同，这种下降可能与我国仔猪大肠杆菌灭活苗的广泛使用有关。

     毒力岛常在tＲNA位点及噬菌体整合位点邻近，两侧常具有同向重复序列，偶尔为插入序列，携带潜在的可移动成分(如IS成分、整合酶、转座酶、质粒复制起始区)，具有不稳定性。毒力岛存在于许多病原菌中，可能与新发现的病原菌及细菌的毒力进化有关［18］。研究发现，断奶仔猪腹泻大肠杆菌和新生仔猪腹泻源大肠的携带率相差很大，分别为27.14%和58.18%，这为耶尔森菌HPI的水平转移提供了重要证据。令人奇怪的是健康仔猪粪便样品大肠杆菌中HPI的高携带率，表明HPI只是其毒力因子之一，其致病性还与其他的毒力因子相关。HPI虽然是影响耶尔森菌和大肠杆菌毒力特性的最普遍要素，而且是感染人和动物不同病原体的常见毒力因子，但对其致病机制还需要深入细致的研究才能真正说明其毒力作用。

     通过细菌的分离鉴定固然是诊断新生仔猪腹泻的常用方法［19］，但也存在明显的不足。在仔猪肠道内存在着多种构成菌群的大肠杆菌，从直肠样品很难从众多的大肠杆菌中分离到ETEC。本研究建立的快速诊断方法正是通过对病料增菌后即用于PCＲ检测，不但可快速确定是否存在感染，而且具有检出率高的优点，更适合于临床活体病例的诊断。

(盐城市畜牧兽医站，纪家玉)