猪链球菌是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症以及突发性死亡。猪链球菌生物被膜的形成是导致猪链球菌病难以控制的主要原因。关于猪链球菌病的防治，目前，尚无理想的疫苗来预防该病，抗生素在预防和治疗猪链球菌病中起着重要的作用，由于抗生素的不合理使用，使猪链球菌耐药性越来越严重，给该病的防控带来了困难。抗生素的耐药问题除了与耐药菌株的大量产生有关外，还与致病菌在机体内以生物被膜的方式生长密切相关［1］。本试验采用微量板半定量法和结晶紫染色法对从新疆南疆片区分离的猪链球菌进行生物被膜阳性菌株筛选，同时检测新疆特色中草药对猪链球菌生物被膜形成的影响，为猪链球菌病的防治寻找新思路。

     金银花50g、马齿苋50g、罗布麻50g。

     1.1.2菌株

     2009年10月，从阿克苏地区某大型养猪场及周边散养户处，采集疑似猪链球菌病的病猪的病变关节液，无菌采集急性死亡的病猪心血、肝、脾、肺及肠系膜淋巴结等病料，经过病原的分离鉴定而得到，这15株猪链球菌由实验室冷藏保存备用，菌株分别为5－123、5－169、8－24－3、42、40、45、9、43、44－1、29－2、52－2、61－1、22、37－3、45－2。

     1.1.3培养基

     脑心浸液(BrainHeartInfusion，BHI)购自京赛百奥科技有限公司。

     1.1.4试剂

     0.1%结晶紫染色液、33%乙酸溶液。

     1.2猪链球菌株生物被膜的检测方法［2］

     从冰箱中取出甘油保存的菌株，待菌液溶解后，分别取100μL菌液接种于3mL脑心浸液液体培养基中，在37℃下培养24h。用接种环蘸取上述菌液划线接种在脑心浸液固体琼脂培养基上，37℃培养24h。从固体培养中挑取单个菌落接种于3mL脑心浸液液体培养基中，37℃下培养8～12h。该菌液为测试菌液。

     1.2.2猪链球菌生物被膜的培养

     在96孔板中每孔加200μL灭菌的BHI，每孔再加已复苏的菌液30μL，每个待检菌株做两列，共16孔，其中第1，2孔只加培养基不加菌液，作为阴性对照。将接种好的96孔板放置在37℃恒温培养箱内培养60h。

     1.2.3结晶紫染色法半定量测定生物被膜形成量

     弃去96孔板中的培养液，将附着在96孔板上的被膜用200μL甲醇固定30min。弃去固定液，待自然风干后，室温下用200μL0.1%的结晶紫对生物被膜染色30min，弃去染色液，用自来水洗2次，干燥。将干燥的96U型孔板中加入200μL乙酸溶液，置于摇床振摇30min以释放结晶紫染液。用酶标仪在630nm波长测定吸光度。

     1.2.4猪链球菌生物被膜的形成能力判定标准［3］

     临界值(ODc)=阴性对照的平均值+(3×阴性对照的标准差);当OD≤ODc时，判定细菌无生物被膜形成能力;当ODc＜OD≤2ODc时，判定细菌生物被膜形成能力较弱;当2ODc＜OD＜4ODc时，判定细菌生物被膜形成能力中等;当4ODc＜OD时，判定细菌生物被膜形成能力强。

     1.3菌株最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

     ［4］每种中药均按水提法进行制备。以中药金银花为例:取金银花50g，置于烧杯，加5～10倍的纯化水浸泡4h后煎煮，武火加热至沸后文火维持30min，用4层纱布过滤，滤出煎液，滤渣按上述方法再煎煮2次，合并3次滤液，浓缩至生药含量1g/mL，1000r/min离心10min，取上清液调pH7.4～7.6，100℃灭菌10min后，置4℃冰箱中保存备用(1周内用完)。

     1.3.2中药对生物被膜形成能力的MIC和MBC的测定方法

     ［3，5］对金银花的敏感性为例:将灭菌好装有1mL的BHI的试管排成一排，编上管号，在第1管内加1mL药液混匀后吸取1mL，至第2管，依次类推至第7管弃去1mL，然后于每管都加入0.1mL已稀释到每毫升含1亿个菌的菌液。第8管为阳性对照，第9管为阴性对照。在恒温摇床内37℃培养18～24h后观察混浊度。以培养物透明、无细菌生长的最低药物浓度作为该药物的MIC。再从透明管取培养物0.01mL接种到BHI琼脂平板于37℃培养24～48h计菌落数。菌落数少于3个视为无细菌生长，以无细菌生长的药物最低浓度作为该药的MBC。试验重复2次，结果取其平均值。根据第1管内的药物浓度为原液的1/2，第2管为第1管的1/2，其余类推，第1管至第9管药物浓度分别为:500，250，125，62.5，31.3，15.7和7.8mg/mL。

     1.4亚抑菌浓度下对猪链球菌生物被膜形成的影响

     稀释药液的制备:采用试管2倍稀释法，取9支灭菌试管进行标号。1号加5mL蒸馏水作为对照。2号至8号加5mL蒸馏水，再在2号加5mL中草药药液，从2号吸5mL混合液至3号，同方法依次稀释至8号，第8管吸取5mL弃去，使其成1∶2，1∶4，1∶8和1∶16等浓度梯度，分别为500，250，125，62.5，31.3，15.7和7.8mg/mL。9号加受试中草药提取物5mL，混匀后，不加菌液，以便观察受试中草药是否被污染。从1号至8号分别添加称取0.185g的脑心浸液培养基。将9支试管在115℃下高压灭菌15min冷却后，用移液枪移取200μL复苏的菌液至8支试管中。再将其在37℃恒温培养箱中培养6～8h。

     1.4.2猪链球菌生物被膜的培养

     将上述不同药物浓度测试菌液依次加到无菌的96孔酶标板中，每次试验每种药物浓度设6个孔，混匀封盖后将96孔板放入37℃恒温培养箱中培养60h。

     1.4.3结晶紫染色法半定量测定生物被膜形成量同1.2.3。

    

     根据公式，测定15株菌猪链球菌生物被膜形成能力结果如下:无生物被膜形成能力有6株，分别是5－123、5－169、40、9、52－2、37－3;生物被膜形成能力较弱有8株，分别是8－24－3、42、45、43、29－2、61－1、22、45－2;生物被膜形成能力中等的1株是44－1。

     2.2中草药抑菌浓度和杀菌浓度

     形成生物被膜能力中等的菌株(44－1号)对3种中药的耐药性较强，MIC和MBC均大于500mg/mL;形成生物被膜能力较弱的菌株(43号)对金银花的MIC是500mg/mL，MBC大于500mg/mL，对马齿苋和罗布麻的MIC和MBC均大于500mg/mL;不形成生物被膜的菌株(40号)对金银花的MIC是250mg/mL，MBC大于500mg/mL，对马齿苋的MIC是500mg/mL，MBC大于500mg/mL，对罗布麻的MIC和MBC均大于500mg/mL。

     2.3在亚抑菌浓度下3种中草药对生物被膜形成能力的影响

     从图1可见，金银花对猪链球菌44－1生物被膜的形成有抑制作用，且药物浓度越高，抑制作用越强。马齿苋在药物浓度在500和250mg/mL时对生物被膜形成能力有明显抑制作用，但当药物浓度≤33.3mg/mL时，可以看出随着药液浓度的下降，菌株产生生物被膜的能力加强;罗布麻叶对生物被膜形成没有抑制作用，反而有促进生物被膜形成作用。生成的生物被膜量相对于低浓度药液显著增多。

     图1亚抑菌浓度下3种中草药对猪链球菌44－1生物被膜形成能力的影响

      

     通过对本实验室分离15株猪源链球菌生物被膜的检测，发现15株菌中9株有不同程度形成生物被膜能力，其中菌株44－1形成生物被膜能力较强。采用金银花、马齿苋、罗布麻叶对形成生物被膜能力不同3株菌进行最小抑菌浓度和杀菌浓度测定，结果显示中草药对猪源链球菌的抑制作用不明显，但可以看出形成生物被膜能力强的44－1菌株的抑菌浓度和杀菌浓度明显比40号菌株高。说明细菌生物被膜的形成对中草药的抑菌作用有明显的影响，但机制有待研究。另外，中草药提取方法对药物的作用效果也有一定影响，本试验是采用水提取法提取的中草药药物成分。

     中草药抗菌作用一直不被重视，原因是抗菌效果远不及抗生素。本次试验结果显示，中草药提取物在高浓度时对细菌生物被膜形成有明显的抑制作用，但随着药物浓度的降低，对生物被膜形成能力不但没有抑制作用，还增强细菌形成生物被膜能力。这可能与中草药提取物成分复杂、提取物中含有增强细菌生物被膜形成能力的成分有关，但具体原因有待进一步研究。

(塔里木大学动物科学学院，吴静，陈瑛，贾桂珍)