试验从水生动物精子低温保存研究意义、研究现状及影响水生动物精子低温保存活力的原因等方面阐述了水生动物精子低温保存技术的相关研究进展，为水生动物精子低温保存技术进一步发展提供一定的参考。

     精子低温保存技术在水产养殖中意义重大:首先，通过建立优良养殖水生动物或濒临灭绝水生动物的冷冻精子库，可将优良水生动物的原良种长期保存起来，从而避免因过渡捕捞、环境污染及生态破坏而造成的水生动物物种灭绝或生产上长期养殖和近亲交配导致种质资源退化及变异现象;其次，通过精子超低温保存，可使生殖期不同步、性逆转及地理隔离的养殖水生动物品系得以交配，以解决如大鲵、花狼鱼(AnarhichasminorOlafsson)等养殖水生动物雌雄鱼不同步成熟，黄鳝等性逆转的个体得以自交，杂交育种中不能自然交配等遗传育种问题，使水生动物人工授精和远缘杂交可行，促进了水生动物种质资源开发与改良;最后，水生动物精子超低温保存技术，可以为水生动物遗传育种和生物技术研究提供材料，极大地促进了水生动物遗传育种研究。

     水生动物精子低温保存技术最早是1953年Blasxter对大西洋鲱鱼(Clupeapallasi)精子进行冻存试验。目前，在鲤鱼、四大家鱼、鳕鱼、虹鳟、鲑鱼、大马哈鱼、大鲵、日本珍珠蚌、欧洲鳗、小体鲟、短吻鲟及花狼鱼等方面的精液低温保存技术应用取得成功。水生动物精子低温保存技术操作流程包括以下几个环节。

     常用的稀释液有:1)Kurokura’s稀释液［1］(3．6g/LNaCl，10g/LKCl，0．22g/LCaCl2，008g/LMgCl2，0．2g/LNaHCO3)。2)TNK稀释液(137g/LNaCl，76．2g/LNaHCO3，20g/LTAPS，pH值为8．2)。3)P1稀释液(125g/LNaCl，20g/LNaHCO3，30g/LKCl，2．5g/LMgCl2，1g/LCaCl2，pH值为8．5)。4)10%甲醇+18%牛胎儿血清+72%海水。5)HBSS稀释液［2］［75．17mmoL/LNaCl，69．90mmoL/LKCl，2．18mmoL/LCaCl·2H2O，1．00mmoL/LMgSO4，1．00mmoL/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH值为8．0］。

     2．2添加冷冻保护剂

     在水生动物精液中添加冷冻保护剂可抑制细胞冻融过程中细胞内部冰晶的形成，防止精子胞膜破裂和线粒体丢失，进而导致细胞功能丧失。常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、蛋黄、甘油、葡萄糖、蔗糖等。

     2．3冷藏

     将添加冷冻保护剂的精液置于0．25～2．00mL冷冻管、安瓶中进行冷冻，常放于液氮上部可调节托盘上，以10～20℃/min降温至－80～－50℃，最后放于液氮罐内。

     2．4解冻

     将冷冻管直接从液氮中取出，放入35～40℃水浴3～10s，将精子等渗液与未完全解冻的精液放入碎冰中，同时振荡2～3s使等渗液与精液混合。

     精液质量、平衡条件、低温保存剂、冻融方法以及授精条件是水生动物精液低温保存技术成功的关键因素。M．Psenicka等［3］与A．Horvath等［4］报道，用相同稀释剂和冷冻保护剂对小体鲟(Sterlet)和短吻鲟(Shortnosesturgeon)解冻精液精子活力的影响，其中小体鲟组精子活力高于短吻鲟组。彭亮跃等［5］报道:中国大鲵(Andriasdavidianus)精液中不添加稀释液在0℃条件下可存活9d，4℃条件下可存活6d;山泉水、Ｒinger稀释液与中国大鲵精液1∶1稀释后可分别存活7d、4d。Kahori等人报道，冷冻速度为－32．4～－22．6℃/min时日本珍珠蚌精子运动性最好可达32．5%，当冷冻速度大于－10℃/min或小于－40℃/min时日本珍珠蚌(Japanesepearloyster)精子活动性最差。有人报道，三种不同蛋黄冷冻保护剂对鲤(Cyprinuscarpio)精子解冻后运动性和受精率的影响，效果由好到差依次为:鸡蛋黄、鹌鹑蛋黄、火鸡蛋黄，其中鸡蛋黄的精子运动性和受精率分别为75．2%、94．0%，显著高于其他组。B．Igor［6］报道，HBSS稀释液冷冻保存大西洋比目(HippoglossushippoglossusL)精液对其精子活力及受精率的影响显著低于MTE稀释液和HＲ稀释液，其中用稀释剂添加蔗糖，甘油作为冷冻保护剂冷冻保存大西洋比目鱼精液效果最佳。王小刚等［7］研究发现，获得点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)精子最佳活力的盐度为15～35，盐度为15时，精子寿命最长为26min，最适pH值范围为6．5～8．0，pH值为7．5时，精子的寿命最长为4min。A．A．Andreev等［8］研究发现，随着冷冻速率的增加，结晶冰的面积和周长减小。在快速薄层冷冻条件下可使防冻剂玻璃化，附加的物质(蛋黄、糖类和脂质)实质上改变了结晶冰的结构和大小。冷冻保存后仍具有活力的精子与防冻剂中结晶冰的大小和结构无关，冷冻保存精子的存活率与圆形微粒形成了模糊的轮廓相关。目前，已报道的水生动物精液冷冻保存。

     目前，水生动物精子的低温保存取得了一些进展，已形成一套较为完整的水生动物精子低温保存技术体系，但还存在不足之处，如精子冻融损伤的发生阶段、时期，不同冻存温度影响精子活力的机理，不同冻存时间影响精子活力的大小程度，抗冻环节的具体作用机理等。目前，冷冻工艺已较为完善，但解冻工艺还有待于进一步研究，以提高冷冻精子解冻后的活力等指标。

     随着研究技术的不断进步及研究的不断深入，水生动物精子低温保存技术将日趋完善，为水生动物种质保存与优良种质培育生产实践带来深远影响。

(1．重庆三峡职业学院，邹仕成，周亚;2．重庆市万州区种畜场，李万;3．四川农业大学动物医学院，周亚)