圆环病毒是猪原发感染中常见的病毒之一，会引起机体的免疫抑制，造成机体的抵抗力降低，容易引起其他病毒或细菌的继发或并发感染，从而引起猪的大量死亡。猪链球菌是猪的重要病原菌之一,可引起猪的多种疾病，侵害各年龄阶段的猪,通常以败血症、脑膜炎、关节炎、淋巴结炎为主要特征，还可引起人类脑膜炎、败血症等，导致严重疾患，至死亡。该菌对养猪业造成严重经济影响，对公共卫生事业构成巨大威胁。由于猪链球菌血清型较多，抗原结构复杂，在临床上又可呈现不同的症状，如败血症、脑膜脑炎、心内膜炎、肺炎、化脓性淋巴结炎、关节炎等，还常常与其他疾病发生合并感染。本文通过对大庆市某猪场送检仔猪的病理解剖和实验室诊断，确诊这一仔猪发病原因是该仔猪同时感染圆环病

毒和猪链球菌，现将诊断过程汇报如下。

     大庆市某猪场20日龄病死仔猪。

     根据GenBank中的基因序列，并参照文献采用Oligo7软件设计了7对引物，由哈尔滨博仕生物有限公司合成。引物序列分别为：

     猪链球菌5'-GATAGATGACGGTTCTTCAGATT-3',

     5'-TCCTCTCCTAACCACTGTTCAG-3';

     胸膜肺炎放线杆菌5'-AAGGTTGATATGTCCGCACC-3',

     5'-CACCGATTACGCCTTGCCA-3';

     

     蓝耳病病毒5'-GCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGG-3',

     5'-GCGTCGGCAAACTAAACTCCACAG-3';

     圆环病毒5'-GAGTCTGGTGACCGTTGC-3',

     5'-TTCCTCCGTGGATTGTTC-3';

     猪瘟病毒5'-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3',

     5'-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3';

     猪多杀性巴氏杆菌5′-AGGGCACGCAGGCGGACTTTTA-3',

     5′-ATCGACAGCGTTTACAGCGTGGA-3′

     仔猪消瘦，喉头充血；肺部有灰褐色炎症和肿胀；肝脏发暗，呈橘黄色外观；肾脏水肿，被膜下有坏灶；脾脏边缘有颗粒状突起；胃粘膜出血。

     将无菌采取病料的病料接种于血琼脂培养基上，置37℃培养24h，观察菌落形态。涂片镜检后挑取单个菌落进行纯培养。

     挑取单个菌落悬浮于含100μL超纯水的1.5mL离心管中，震荡混匀，煮沸10min后于冰上冷却2min，12000r/min离心2min，取上清液作为PCR反应的粗制DNA模板，置-20℃保存备用。

     将动物组织在液氮中充分研磨，按照TIANampGenomicDNAKitDNA提取盒和RNeasyPlusMiniHandbookRNA提取盒的操作步骤，分别提取病毒的DNA和RNA。按照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反转录盒的操作步骤，将提取的病毒RNA进行反转录，得到病毒cDNA。

     以试剂盒提取得到的病毒DNA和cDNA和细菌粗提取得到的模板，用猪巴氏杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、蓝耳病毒、圆环病毒、猪瘟病毒的特异性引物进行PCR反应扩增，PCR产物于1%的琼脂糖凝胶进行电泳后，用紫外凝胶成像仪分析。

     从肺组织中分离的各得到2种细菌，根据菌落形态、大小以及颜色等初步确定一种细菌为大肠杆菌。另一种细菌在血琼脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、边缘整齐、直径0.5~0.75mm的细小菌落。

     将分离纯化的细菌进行革兰氏染色、涂片、镜检。可见细菌形态球形或卵圆形，直径0.6~1.0um，多数呈链状排列，4～8个细菌组成，呈革氏阳性，疑似链球菌。

     琼脂糖凝胶电泳发现，在加样孔4的493bp处看到清晰条带，与圆环病毒Ⅱ型的片段大小相符。在加样孔5的450bp处看到清晰条带，与放线杆菌的片段大小相符。如图1所示。

     对该猪场仔猪的发病原因进行调查：该猪场饲养管理水平低，饲养密度大，饲料不科学；环境消毒不合格，排泄没有无害化处理；免疫程序混乱，没有经过科学的疫苗免疫程序。这些因素给病菌大量繁殖并发生变异的机会，造成多种病菌存在猪只体内，当环境骤变时，猪体抵抗力下降，病原侵入猪体造成严重损失。

     近几年来,猪链球菌病的发病率和死亡率有逐年上升趋势。链球菌的致病性已引起临床工作者和科研人员的广泛关注和重视,国内外许多学者对猪链球菌做了大量的研究工作,已发现的猪链球菌2型的致病因子包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子、蛋白质片段和IgG结合蛋白、溶血素等。猪圆环病毒病是一种免疫抑制性疾病，目前没有有效的治疗方法。

（1.黑龙江八一农垦大学文理学院，吴海涛；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，邢思毅,常春龙,齐晓雪）