近年来，在畜禽养殖及临床治疗过程中针对沙门菌引起的疾病常大量且不合理的使用抗生素，导致细菌耐药性的产生，并且呈现越来越严重的趋势［６］。耐药沙门菌的出现，一方面影响养殖业的发展，另一方面食源性耐药菌可能转移到人体，从而对人类的健康和公共卫生造成威胁［７］。在国外，尤其很多发达国家对动物源性沙门菌细菌的流行、耐药性监控及其耐药机制研究都较早开展，而国内对动物性食品源沙门菌大规模监控、耐药情况及耐药机制研究尚不深入，鉴于此，本研究采集肉鸡养殖、屠宰加工及其产品销售各环节的样品，进行了沙门菌的分离、鉴定及其耐药性检测，为动物性食品源沙门菌研究提供数据。

     １．１　标准菌株　鼠伤寒沙门菌ＡＴＣＣ１３３１１，肠炎沙门菌ＡＴＣＣ１３０７６，鸡白痢沙门菌ＡＴＣＣ１０３９８以及大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２均由中国农业大学药理实验室提供。

     １．２　培养基及生化试剂　缓冲蛋白冻水（ＢＰＷ）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（ＳＣ）、脑心浸液肉汤（ＢＨＩ）培养基、ＭＨ肉汤、ＭＨ琼脂购于中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司；沙门菌科玛嘉显色培养基购于郑州博赛生物技术研究所。肠杆菌科细菌生化编码鉴定管ＧＹＺ－１５ｅ，购于杭州天和微生物试剂有限公司；ＩＤ　３２Ｅ肠杆菌科和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）购于法国梅里埃生物技术有限公司；Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ＠ｖｅｒｓｉｏｎ２．０购于Ｔａｋａｒａ宝生物工程（大连）有限公司；Ｔｒａｎｓ　２ＫＭａｒｋｅｒ购于北京全式金生物技术有限公司。

     １．３　主要仪器与设备　微量可调加样器购自德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；ＭｉＬＬｉＱ超纯水仪购自ＭｉＬｉｐｏｅ公司；ＰＣＲ仪购自Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ购自美国，型号Ｖｅｒｉｔｉ　９６－Ｗｅｌ；凝胶成像系统ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ型号ＡｌｐｈａＩｍａｇ－ｅｒ　２２００。

     １．４　药品　本研究所选取的受试药物如下：多西环素（ＤＯＸ）、美罗培南（ＭＥＭ）、庆大霉素（ＧＥＮ）、氯霉素（ＣＨＬ）、萘啶酸（ＮＡＤ）、头孢噻呋（ＥＦＴ）、氨苄西林（ＡＭＰ）、阿莫西林／克拉维酸（ＡＭＣ）、头孢唑啉（ＣＦＺ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、复方新诺明（ＳＸＴ）、头孢曲松（ＣＲＯ）等抗生素标准品，其中萘啶酸购于美国Ｓｉｇｍａ公司，其余均购于中国兽医药品监察所。

     １．５　菌株的分离与鉴定

     １．５．１　样品的采集、运输及沙门菌的初步鉴定　菌株分离样品来源为２０１２年９－１０月上海市某大型养殖场的待宰肉鸡、屠宰胴体和市售鸡肉。样品置于低温环境中（约４℃）立即运送至实验室进行沙门菌的分离鉴定。按ＧＢ／Ｔ４７８９．４－２０１０进行。按照肠杆菌科细菌生化编码鉴定管ＧＹＺ－１５ｅ的说明书进行生化鉴定。对于一些难以确定的菌株，配合使用ＩＤ　３２Ｅ肠杆菌科和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法），试条经接种、孵育２４ｈ后，用ＡＴＢＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴＭ仪判读结果。

     １．５．２　沙门菌的ＰＣＲ鉴定　采用水煮法粗提菌体ＤＮＡ，作为ＰＣＲ反应体系中的模板。根据Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ　Ｍ９０８４６鼠伤寒沙门菌ｉｎｖＡ基因序列设计引物，上游为：ｉｎｖＡ－Ｆ：５′－ＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴ－ＧＧＧＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣ－３′，下游为：ｉｎｖＡ－Ｒ：５′－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＧＴ－３′，扩增目的片段大小为４２０ｂｐ，引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。反应体系（２０μＬ）：上、下游引物各０．５μＬ，２ｘＴａｑ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（含染料，Ｔａｋａｒａ）１０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　８μＬ，模板１μＬ。以沙门菌标准株ＡＴＣＣ１３３１１为阳性对照，以大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２和纯水为阴性对照。

     反应条件：９５℃预变性１０ｍｉｎ，然后进入３０个循环：９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ；最后７２℃１０ｍｉｎ。结果观察：１％琼脂糖凝胶电泳含Ｇｏｌｄ－Ｖｉｅｗ　ＤＮＡ染料５ｍＬ／１００Ｌ，缓冲液为１×ＴＡＥ，１５０Ｖ衡压电泳２０ｍｉｎ后用凝胶成像系统观察结果。随机挑选了阳性ｉｎｖＡ基因的１０％，ＰＣＲ产物经胶回收纯化后，送上海英骏生物技术有限公司北京分公司进行测序，结果用ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）的ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｂｌａｓｔ比对序列。

     １．６　抗菌药物敏感性试验　按美国临床实验室标准委员会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｉｎｓｔｉ－ｔｕｔｅ：ＣＬＳＩ）推荐的肉汤微量稀释法进行，对分离的所有沙门菌进行１２种临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）测定。大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２作为质控菌株，结果判定参照ＣＬＳＩ（２０１１）标准。

     ２．１　沙门菌的鉴定结果及分离率　沙门菌疑似菌株经科玛嘉显色琼脂培养后，菌落形态为紫色、淡紫色，边缘光滑；镜检为革兰阴性、两端钝圆的短杆菌。ＰＣＲ扩增出ｉｎｖＡ的目的片段大小为：４２０ｂｐ。待宰肉鸡、屠宰光禽和市售鸡肉３个环节依次分别采集３８８份（泄殖腔拭子）、２００份（胴体拭子）和１２７份（胴体拭子）样品，通过生化和ＰＣＲ鉴定，共获得７３株沙门菌，总检出率为７．６９％。不同环节沙门菌的分离鉴定情况见表１。

    

     从表中数据可以看出，不同来源沙门菌的分离情况差别较大。其中，屠宰胴体的分离率最高，达到了１７．５０％。待宰肉鸡沙门菌分离率最低，仅为２．３２％。另外值得关注的是，市售鸡肉的分离率虽然低于屠宰线上胴体的分离率，但是也达到了８．６６％。

     ２．２．１　不同环节分离菌株对１２种常用抗菌药物的耐药情况　抗菌药物敏感性试验测试结果见于表２。从整体上来说，复方新诺明和多西环素的耐药率最高，分别为１００％和９５．８９％；对头孢唑啉、阿莫西林／克拉维酸、氯霉素、萘啶酸、环丙沙星的耐药率也很高，依次为５０．６８％、４３．８４％、４３．８４％、４１．０％、３６．９９％；而对头孢噻呋、头孢曲松、庆大霉素、美罗培南的耐药率相对较低。

     不同环节采集样品分离菌株的耐药情况表现出差异性，其中待宰肉鸡分离株的耐药情况最严重，此环节所有分离株对复方新诺明和多西环素均表现为耐药，并且对阿莫西林／克拉维酸、氯霉素、氨苄西林、萘啶酸、环丙沙星、头孢噻呋、头孢曲松等七种抗菌药物的耐药率明显高于其他两个环节的分离株。屠宰胴体分离株与其他环节的差异主要表现为对头孢唑啉的高耐药率，而市售鸡肉分离株的耐药情况相对轻微，主要是对复方新诺明和多西环素两种抗菌药物的耐药率较高。

    

     ２．２．２　不同环节沙门菌对１２种抗生素的多重耐药情况　对多重耐药分析结果表明，３个环节的分离菌株对本试验涉及的１２种抗生素表现为严重的多重耐药，所有分离株至少对２种药物表现耐药。不同环节分离所得的菌株，多耐药数差别较大，待宰肉鸡以７耐（３３．３３％）为主；屠宰胴体以３耐（２９．００％）和８耐（２５．００％）为主；市售鸡肉则以２耐（６８．７５％）为主。其中１株分离自待宰肉鸡的沙门菌对１２种抗菌药物表现为全耐。

     ２．２．３　不同环节沙门菌耐药谱型比较　对抗菌药物耐药谱型分析，共有１９种耐药谱型，其中１２、１１、９、６、５、３、２重均只有１种，１０重有２种，８重和４重均有３种，７重有４种。不同环节分离的沙门菌耐药谱有较大的区别，屠宰胴体环节具有最丰富的耐药谱型，多达１３种，待宰肉鸡次之，为７种，市售鸡肉耐药谱最简单，仅有４种；每个环节主导耐药谱型也不一致：待宰肉鸡以ＡＭＰ－ＡＭＣ－ＣＨＬ－ＣＩＰ－ＤＯＸ－ＮＡＤ－ＳＸＴ（２２．２２％）和ＤＯＸ－ＳＸＴ（２２．２２％）为主，而屠宰光禽主导谱型为ＤＯＸ－ＣＦＺ－ＳＸＴ（２９．１７％）和ＡＭＰ－ＡＭＣ－ＣＨＬ－ＣＩＰ－ＤＯＸ－ＣＦＺ－ＮＡＤ－ＸＴ（１８．７５％），市售鸡肉则以ＤＯＸ－ＳＸＴ（７５．００％单一谱型为主.

    

     本研究，从上海市某大型肉鸡企业的待宰肉鸡、屠宰胴体和市售鸡肉３个环节的样品中，共获得沙门菌７３株，总检出率为７．６９％。其中待宰肉鸡的检出率最低，仅为２．３２％，这一结果与国内薛俊龙等［８］报道的山东省成年鸡泄殖腔拭子沙门菌分离率较为相近，说明虽然地区不同，但是国内肉鸡养殖中沙门菌的感染情况相似。市售鸡肉的检出率为８．６６％，远低于澳大利亚零售鸡肉沙门菌的检出率９］，导致的原因，一方面可能是本次采集的样品有限，并不能真实的反应国内肉鸡市场沙门菌的污染整体情况；另一方面本次采集的鸡肉，运输环节简单、工具洁净以及市场管理规范，也可能是鸡肉沙门菌检出率较低的原因之一。屠宰胴体的检出率最高，可达１７．５０％，这与丹麦一大型肉鸡屠宰场沙门菌检出率为２７．５％的报道，存在较大的差异［１０］。３个环节沙门菌的检出率，差异明显，特别是屠宰胴体的分离率远高于待宰肉鸡，这说明，在肉鸡屠宰加工的过程中存在较为严重的交叉污染。目前有研究表明，屠宰加工过程中，分割鸡肉经过加入含有５０×１０６～１００×１０６次氯酸钠的预冷水（水温控制在０～４℃）处理后，沙门菌的检出率可以在一定程度上降低［１１］。

     药敏结果显示，所有分离株至少对２种药物表现耐药，最严重的是对所试抗生素全部表现为耐药。就单一抗生素而言，对复方新诺明和多西环素的耐药率最高，分别为１００％和９５．８９％，这与之前国内的报道一致；而大多发达国家和地区所报道的沙门菌对磺胺类和四环素类的耐药率则相对较低。总体上比较发现，不同环节采集样品分离菌株的耐药情况表现出差异性，其中待宰肉鸡分离株的耐药情况最严重，屠宰胴体分离株次之，而市售鸡肉分离株的耐药情况相对轻微。这一现象可能是由以下两个因素造成的：一方面这些菌株虽然分离自同一个肉鸡生产链，但并非完全来源于同一批肉鸡的样品，来源不同，耐药性也就不同。另一方面也可能是屠宰胴体环节分离菌不仅仅来自待宰肉鸡，还有来自屠宰加工过程的环境中，并且环境中的沙门菌耐药情况轻微，随着肉鸡产业链延伸，沙门菌的来源越来越复杂，受环境的影响越大，因此屠宰胴体分离株和市售鸡肉分离株的耐药情况都较待宰肉鸡的轻微。

     由沙门菌引起的食物中毒，占所有食物中毒事件的９％，占细菌中毒的一半以上。而在引发食物中毒的事件中，五分之一与禽肉相关，也就表明家禽是主要的食物中毒的食品载体。并且多重耐药沙门菌株会通过食物链通过动物向人类传递，其耐药性获得的途径主要为基因突变、外排泵、耐药基因编码的钝化酶和灭活酶的产生、可移动的细菌遗传耐药基因元件及其转移。因此，亟需加强养禽业抗菌药物的合理应用，遏制沙门菌耐药性的不断发展，从而保障消费者的健康。

（四川农业大学动物医学学院，谢懋英,左之才；中国农业大学赖　婧,马立才,吴聪明）