猪繁殖与呼吸综合征的大规模流行，不仅对各国养猪业造成了严重影响，也对人类健康和全球经济安全造成了巨大威胁。如何在复杂的致病原中快速准确的诊断和监测猪繁殖与呼吸综合征，具有重要的经济学意义和公共卫生学意义。因此，猪繁殖与呼吸综合征检测诊断技术成为了世界各国的研究重点和申请专利的热点，掌握猪繁殖与呼吸综合征检测诊断技术在全球和中国范围内的专利申请情况，对其发展趋势和研究重点进行研究和分析，合理利用现有专利技术，对有效控制猪繁殖与呼吸综合征疫情具有重要的现实意义和深远的战略意义。

     本文以中国专利文献检索系统（CPRS）和德温特世界专利索引数据库（WPI）为文献来源，在相关领域主要分类号（A23L、A23K、A01K、A61K）中，以猪繁殖与呼吸综合征、防控、治疗、预防、检测等关键词进行中英文检索，检索截止日为2014年5月23日。在WPI数据库中检索到涉及猪繁殖与呼吸综合征的全球专利申请共计540项。

     以下从专利申请整体趋势、申请国家或地区分布、申请人类别、技术主题等角度对猪繁殖与呼吸综合征领域的世界和国内专利状况进行分析。

     从申请数量上就可以看出，猪繁殖与呼吸综合征防控专利大大落后于禽流感病毒（截止到2014年4月1日，8408件）、冠状病毒（截止到2014年4月1日，4709件）等可以导致人畜共患病的热门病毒。由图1可知，在2002年以前，在全球范围内猪繁殖与呼吸综合征检测技术专利申请数量较少。2004年，全球申请量和中国申请量都出现大幅度的提升，尤其是在2009年之后，世界申请量和中国申请量都呈爆发式增长，这与世界范围内对猪繁殖与呼吸综合征的重视程度的提升和“猪高热病”在全球范围内的流行有密切联系。

     反观我国猪繁殖与呼吸综合征检测技术专利申请量的发展态势，也呈现出逐年上升的趋势，这种趋势不仅与国家出台相关政策和方案息息相关，也与我国规模化养殖和生产的不断铺开相关。虽然猪繁殖与呼吸综合征并非为人畜共患病，但是对农业生产造成了严重的影响。相信随着我国猪繁殖与呼吸综合征防控体系的逐渐完善、社会各界对猪繁殖与呼吸综合征防御意识的逐渐提高，未来几年我国在该领域的专利申请量将继续保持增长态势。

    

     

     从图2中可以看出，猪繁殖与呼吸综合征专利申请量在全球各个国家和地区间的分布不均衡，其中中国专利申请量最多（134件），占全球相关专利申请总量的21%，美国紧居其后，这与国家的战略部署有直接关系，同时也说明我国对猪繁殖与呼吸综合征防控技术的研究和专利保护也比较重视。国家政策的影响力同时也体现在韩国和日本的相关专利申请数量上，2者分占全球申请量的7%和2%。由此可见，政府导向对专利申请的影响巨大，这也为我国政策制定给出了技术启示。

     

     图3显示了我国各省份的猪繁殖与呼吸综合征领域专利申请量分布，前3位分别是辽宁、北京、广西，这与上述3省市是国内养殖大省和消费大省的现状紧密联系，在上述3省市中，农牧业，尤其是生猪养殖是其支出型产业，产业和科技的联系也从中有所体现。

     

     猪繁殖与呼吸综合征防控相关中国专利申请量排在前10位的申请人是：中国动物疾病预防控制中心（11件）、南京农业大学（9件）、华中农业大学（8件）、西北农林科技大学（8件）、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（6件）、中国农业科学院兰州兽医研究所（6件）、吉林大学（5件）、中国农业大学（5件）、福建省农业科学院畜牧兽医研究所（4件）、华威特（北京）生物科技有限公司（4件）、武汉中博生物股份有限公司（4件）。

     从整体上看，国内高校及科研院所的相关中国专利申请量居多（75件），这与我国研究重点还处于高校和科研院所阶段相联系，相关研究成果还处于实验室阶段，并没有完全、高效的转化为生产力。国内企业的申请量为36件，这些企业几乎都是生物公司，且都与高校或者科研院所有科研联系。从中可以发现，国内相关企业可以加强与高校和科研院所之间的横向联系，充分发挥产学研结合的作用，实现创新成果转化，抢占猪繁殖与呼吸综合征检测诊断技术的市场，推动这一领域的科技进步。同时，值得注意的是，国内个人的申请量为22件，这些申请虽然发明点较低，但也说明我国民间发明创造的热情，是我国科技发展中不可获取的组成部分。

     在相关中国专利申请中，国外企业来华申请占10.4%（14件），国外研究院所来华申请占6.2%（8件）。从中也可以发现，国外企业对中国市场的重视程度，而且随着知识产权意识在全球范围内的不断深化，这种重视程度会不断加强。同时，国外企业在全球范围内的猪繁殖与呼吸综合征检测领域专利布局也会不断加强，这种趋势需要得到我国相关部门重视。

     在猪繁殖与呼吸综合征防控技术领域，专利申请量居首的为猪繁殖与呼吸综合征治疗用药领域，其次为猪繁殖与呼吸综合征诊断与检测技术领域。作为中国传统文化，利用中药进行猪繁殖与呼吸综合征的预防和治疗是中国专利申请中的一个特色，而且所占比例达到40%，这也说明利用本国传统对现代疾病进行防控也是发展方向之一。作为中国传统文化的重要组成部分，中医中药理念不但不应该被舍弃，而应该使其在科技的进步中发挥其更重要的作用。

     至于检测和诊断方面，猪繁殖与呼吸综合征作为一种传染病，其防控主要涉及3个阶段：诊断、治疗及预防，其中快速检测、早期诊断是及时治疗的重要基础，也可为流行病学调查提供快速、灵敏的手段。另外，有资料显示，猪繁殖与呼吸综合征病原体的变异在明显加快，这也给猪繁殖与呼吸综合征病毒检测提出了更高的要求。考虑到这些因素，笔者锁定猪繁殖与呼吸综合征病毒检测这一技术主题作深入分析，以期为猪繁殖与呼吸综合征检测和诊断技术的研究和发展提供参考。

     猪繁殖与呼吸综合征病毒感染宿主后，其病理变化因感染毒株毒力的强弱、病程的长短和宿主的不同而有所不同，临床症状也表现各异，仅通过临床症状和流行病学特点很难对其进行确诊。目前，猪繁殖与呼吸综合征的检测方法可分为病毒分离病原学检测、病毒抗原抗体分析技术和病毒核酸分析技术3大类。

     病毒分离是检测PRRSV最准确的一种方法。目前用于PRRSV增殖的细胞主要有原代猪肺泡巨噬细胞及来源于非洲绿猴肾细胞系的MA-104细胞、CL2621细胞、Marc-145细胞及克隆自Marc-145细胞的HS.2H细胞。有报道，猴源SJPL细胞系非常适合PRRSV复制，其产生的病毒滴度与Marc-145细胞相当，可用于PRRSV的分离与研究。在病毒分离过程中，通常选取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾脏和血清等病料用于分离PRRSV。将组织匀浆上清或血清接种敏感细胞后，观察是否出现特征性的细胞病变，主要表现细胞聚集、圆缩、固缩、脱落。研究发现，不同的病毒株适合生长在不同的细胞上，有的毒株仅生长在一种细胞上，有的则生长在多种细胞上，但大多数毒株特别是欧洲型毒株均适应原代猪肺泡巨噬细胞，因此在分离欧洲型毒株时应尽量采用原代猪肺泡巨噬细胞。不同分离株在敏感细胞培养物上增值情况不同，有些毒株在病料接种后第1代细胞培养即出现细胞病变，有些毒株则需在第3代才出现细胞病变，而有些毒株则不出现细胞病变，情况较为复杂。经典的病毒病原学检测方法由于需要将病料接种细胞或进行组织培养，耗时较长（几天到1周不等），存在滞后性，无法满足急性烈性传染病紧急疫情防治工作的需要，而且可能会造成假阳性。

     为了满足快速检测的需要，在现阶段，病毒抗原抗体分析技术和病毒核酸分析技术在猪繁殖与呼吸综合征检测中发挥着主导作用。而在专利申请内容中，我国猪繁殖与呼吸综合征检测领域最主要的研究热点集中在酶联免疫吸附试验（ELISA）、RT-PCR技术、核酸探针技术、ELISA、基因芯片、环介导逆转录等温扩增技术6大方法上。

     在检测技术方面，国外的优势还是相对明显。采用感染性分子克隆技术得到的产物进行猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的相关专利较多，采用多重或荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的专利也占有一席之地，同时，还有采用微阵列技术、胶体金试纸条进行病毒检测的报道。相对而言，以美国、法国研究机构和企业为首的许多国外研究机构和体外诊断试剂开发企业，从检测的灵敏度、精确性等方面对使用ELISA技术检测诊断猪繁殖与呼吸综合征进行了深入研究。日本、新加坡等亚洲国家在猪繁殖与呼吸综合征检测技术及试剂盒的开发方面也表现不俗。现在国外的猪繁殖与呼吸综合征检测技术主要发展趋向为高通量、迅速、特异。国外猪繁殖与呼吸综合征疫苗相关专利多为基因工程类疫苗，例如具有标记功能的重组猪繁殖与呼吸综合征疫苗、采用反向遗传操作的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性分子克隆的构建，还有转基因植物疫苗也有专利报道。国外在猪繁殖与呼吸综合征治疗方面也侧重于利用分子生物技术进行相应的辅助治疗，包括植物提取物的免疫增强疗法和重组猪繁殖与呼吸综合征病毒疗法等。

     猪繁殖与呼吸综合征检测技术由最初的病毒分离与鉴定、经典血清学诊断方法，发展到更快速简便的免疫学和分子生物学方法，近几年又出现了融合多学科精髓的高通量芯片技术，使得猪繁殖与呼吸综合征检测技术逐步向着高灵敏度、高通量、更迅速、更特异、更简便的方向迈进。

     （1）单克隆抗体检测：随着单克隆抗体筛选技术的不断进步，利用该技术为核心检测猪繁殖与呼吸综合征成为科研发展重点，包括以单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验、胶体金法、ELISA法等。该技术的关键点在于抗体结合的特异性和敏感性，这些用于检测的单抗中大部分是针对美洲型和欧洲型毒株上相对保守性抗原位点，只有少部分单抗是针对部分毒株发生反应，合理的利用这些单抗进行检测，会具有较高的检出率。专利申请CN102297969A提供了一种仅能识别传统美洲型PRRSV的杂交瘤细胞Mab-B47株，保藏在CCTCC（中国典型培养物保藏中心），保藏日2011年4月15日，保藏编号：CCTCCC201122。利用上述单抗检测时间为40min，与病毒分离符合率达92.5%，与RT-PCR检测试剂盒的符合率达92.2%，表明该方法试验结果准确、可靠，可用于传统美洲型和变异型PRRS的鉴别诊断，具有很好的临床应用价值。

     （2）酶联免疫吸附试验：ELISA敏感性高、特异性强、操作简便，适用于大规模检测，是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，被广泛用于检测PRRSV抗体，而用于检测PRRSV抗原则鲜有报道。目前，国内的主要申请重心为商业化的ELISA检测试剂盒，其申请人主要是与高校或科研院所合作的国内企业。虽然ELISA法用于PRRSV的检测方法发展迅速，已经成为一种比较成熟的诊断方法，但是作为免疫检测技术，还存在一定局限性，如血清中可能存在感染试验的因素干扰试验的结果。针对这一难题，武汉中博生物股份有限公司的专利申请CN103364551A公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，其中，所述检测用抗原为纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶－抗PRRSV抗体酶结合物。本发明试剂盒的特异性达100%，灵敏度高达1：800，可用于猪群PRRSV感染的早期诊断。

     （3）核酸探针杂交技术：核酸探针杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具，为从分子水平探讨猪繁殖与呼吸综合征的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。为满足对流感疫情的早期控制预警的要求，该技术多结合基因芯片技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测，实现高通量、大批次的检测效果。例如，专利申请CN102382905A提供了一种同步检测猪圆环病毒Ⅱ型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2、CSFV3种病毒核酸设计3对特异性探针，可同时对上述3种病毒进行检测、分型或鉴定，并能鉴别病毒的高致病性，大大缩短了检测时间，且提高了检测准确率。

     （4）PCR技术：PCR是鉴定PRRSV基因组的一种很有效的方法，在猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方面，可通过选择株特异性引物扩增，不仅可以将美洲株与欧洲株区分开，而且可以将国内的经典毒株和高致病性缺失变异毒株进行鉴别诊断。在此基础上，实时荧光定量PCR是将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号积累对整个PCR进程实时监测，该方法的优点是敏感性要比常规RT-PCR高100倍以上，而且自动化程度较高。该方法更多地被应用于病毒的分型检测上。广西壮族自治区动物疫病预防控制中心在103725793A公开了一组用于猪繁殖与呼吸综合征病毒多重荧光定量RT-PCR方法，引物包括AM-PRRSV引物对和TJM-PRRSV引物对，探针包括AM-V-PRRSV-P探针、AM-C-PRRSV-P探针、TJM-PRRSV-P探针，可同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、HP-PRRSV及高致病性PRRSV活疫苗TJM-F92株，具有特异性强、敏感性高、自动化程度高优点。

     （5）环介导逆转录等温扩增技术：环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是2000年Notomi等建立的一种新的体外核酸扩增技术，该技术可以不需任何PCR仪和检测仪，通过具有链置换活性的DNA聚合酶的合成作用，在60℃左右的恒温条件下特异、高效、快速地扩增靶序列，不到1h就能扩增109倍，扩增产物可以直接观察。LAMP技术不但可以检测DNA，在反应体系中加入反转录酶后也可检测RNA，并且反转录和等温扩增可以在同一反应管中进行。建立能灵敏、特异性强地诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒亚型的RT-LAMP方法的前提是针对病毒亚型基因亚型保守区设计特异性引物。中华人民共和国珠海出入境检验检疫局的杨素等人在102277445A中针对上述需求，根据GenBank公布的PRRSV不同亚型的基因序列，在PRRSV核衣壳蛋白（Ｎ蛋白）ORF7基因保守序列的6个区域设计2对特异引物，经反应体系、反应条件优化及敏感性和特异性试验，建立了蓝耳病病毒（PRRSV）RT-LAMP检测方法。通过敏感性试验证明：本发明建立的PRRSVRT-LAMP检测方法可特异性的检测PRRSV，具有良好的特异性。能检测到0.015pg/μl的PRRSVRNA，而RT-PCR仅能检测到0.15pg/μl的RNA，是常规RT-PCR的10倍，具有较高的敏感性，完全可以满足野外、现场和基层部门蓝耳病病毒检测的需要。

     （6）基因芯片和蛋白质芯片检测技术：基因芯片就是将大量已知DNA序列的探针通过一定方式固定于某种固相载体表面，形成致密、有序的DNA分子点阵。利用抗原抗体结合特性制备的蛋白质芯片技术不仅保留了抗原抗体反应快速、灵敏和特异性的特点，还可以满足生物样本多指标分析的需要，因此比较有利于大规模推广和产业化应用。但该技术的主要障碍就是筛选到敏感性好和特异性高的标志物，在混合样品中检测出目的致病源。山东澳兰生物工程研究院的专利申请CN1616682A中提供了一种用于诊断猪病毒病的基因芯片，其中包括：固定在固相载体上的与待检致病病原种类相对应的待测致病病原特征性DNA和/或cDNA片段，其中采用的特征性片段由猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪轮状病毒、猪流行性乙型脑炎病毒病原基因特征性片段组成，可快速高效的对上述10种病毒进行检测，与现有技术中的病毒分离法、ELISA法相比较，符合率为96%。

     PRRSV的检测方法众，各有其优缺点。在实际临床应用中，必须充分考虑每种检测方法的优点和局限性，结合抗原、抗体检测结果及流行病学和疫苗的免疫情况，才能了解猪群实际感染情况并做出适当的应对措施。病毒分离、IPMA、IFA等方法虽然结果可靠，但由于猪繁殖与呼吸综合征病毒自身的变异特点，导致操作繁琐、费时，重复性差，限制了实际临床中的快速诊断，但传统的诊断方法由于效果直观在猪繁殖与呼吸综合征病毒的初次分离和亚型鉴定中起着非常重要的作用。血清学方法是目前广泛应用于实验室的诊断方法，其操作简单，敏感性和特异性都较高，在PRRSV的诊断中发挥着重要的作用，但检测结果不能区别疫苗抗体和感染抗体成为了此类方法的最大缺点。直接检测病毒基因的分子生物学方法对于PRRS的诊断具有重要的意义。随着分子生物学的发展，基于分子生物学原理建立的方法，为快速准确的诊断和监测猪繁殖与呼吸综合征提供了有效的方法。因此在今后的发展方向上，应把传统的猪繁殖与呼吸综合征诊断方法和现代的分子生物学诊断新技术有效的结合起来，为有效诊治和防制猪繁殖与呼吸综合征提供科学依据。

     此外，现有技术中尚有多种新兴的检测手段，例如聚合酶链反应与变性高效液相色谱技术（denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC）。2012年，杨春华等根据PRRSVORF5基因设计特异性引物，利用RT-PCR扩增产物结合变性高效液相色谱技术分析，建立了PRRSV的PCR-DHPLC检测技术，可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。近年来，SongJY等利用米氏散射免疫凝集试验（Miescatteringimmunoagglutinationassay）制备微流体免疫传感器，用于检测PRRSV美洲型毒株。该方法是在Y形的微通道中，抗PRRSV抗体被结合到高度羧酸化的聚苯乙烯微颗粒表面，并与稀释的PRRSV组织样本混合。抗原抗体结合引发微粒免疫凝集反应，这种反应通过微钳体光380nm入射光束的45°角前倾光散射来检测。该法灵敏度达到10-3TCID50/ml，高于普通RT-PCR的10TCID50/ml及FQ-RT-PCR的1TCID50/ml，且耗时短，每个试验不到5min。在微流体芯片上进行免疫凝集试验有望发展成为一种实时检测动物病原体的重要方法。

     猪繁殖与呼吸综合征作为猪的一种重要传染病，严重危害养猪业健康发展。尤其是近年来人流感、猪繁殖与呼吸综合征、猪流感、禽流感呈现出混合感染、混合发病的趋势。其中猪作为病毒储存宿主和混合器的作用，已经引起了人们对公共卫生安全的高度重视。如何更好的合理利用知识产权，提升产业和行业的整体水平，需要政府与企业共同努力。生猪养殖作为我国战略性的稳定保证，需要更高效、完善的技术防护和支持，其中专利发挥的作用必定越来越重要。

     针对以上情况，我国应当将养殖产业发展与相关区域规划统筹考虑，尤其是在山东、浙江等农业生产大省，为生猪养殖及产品加工领域在立项、资金、税收各方面提供针对性的产业政策支持，需要建立政务政策为导向的领域发展战略，进一步提升和稳定生猪养殖的战略地位，用技术为生产保驾护航。其次，应积极进行产业结构转变，从小规模，散户经营转化为大规模养殖场和生态养殖，从劳动密集型向资本密集型、环境友好型转变，这样既有利于产品品质的提升和稳定，又易于通过产量优势形成地区或企业优势，打造知名品牌，提升竞争力；再次，还应加大对猪繁殖与呼吸综合征防控相关产品的研究力度，延伸产业链长度，提升产品附加值；另外，应大力推进产学研一体化，企业领导人应该主动联系科研院所，多学习，多交流，使产业资本与高校和科研院所人才和技术的优势有效对接，加快产业发展速度。

（1.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，吕健；2.中国农业科学院上海兽医研究所，吕健，袁世山，童光志）