伪狂犬病(Pseudorabies，PＲ)是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PＲV)引起的猪、牛、羊等多种动物共患的急性传染病。本病主要表现为发热、脑脊髓炎、奇痒、呼吸和神经系统障碍等特征性变化，具有发病急、传播速度快、病死率高等流行特点，给全球畜牧养殖业带来了巨大的经济损失。猪是本病的主要原发宿主和长期的带毒者，感染最为普遍，羊感染伪狂犬病病毒的过去报道较少，但近几年来，羊感染伪狂犬病毒的报道逐渐增多，表现出潜在的流行之势。2013年3月，青海省某养殖户饲养的青海山羊发生了以体温升高、厌食、精神沉郁、剧痒为主要特征的疾病。根据发病情况、临床症状、剖检病变和实验室诊断，最后确诊为伪狂犬病。疫病确诊后采取了扑杀、焚烧、深埋、免疫接种等系列强制性预防控制措施。现将诊断过程报告如下。

     2013年3月份，青海省某地区养殖户饲养的40余只青海山羊中有1只上午突然发病，初期表现精神沉郁、厌食、离群站立、呼吸加快，当日下午该病羊不断用后肢挠同侧鼻脸部，前肢抓挠面部致被毛脱光、皮肤擦破，仍不停，同时表现出不安、摇头、转圈等现象。至晚上该病羊已不能站立，倒地横卧，最后因身体衰竭而死亡。次日，该群羊陆续发病，共有3只羊死亡。

     病羊主要表现厌食直至绝食，精神萎靡，呼吸加快，体温升高至41℃以上，唇部、眼睑及整个头部表现奇痒，摩擦、撕咬发痒部位。病羊后期表现站立不安、转圈、摇头等神经症状，同时口腔有泡沫状唾液，鼻腔有浆液性鼻液，眼结膜充血，流泪。

     剖检病死羊，可见脱毛部位皮肤溃烂，皮下严重水肿;肝、脾、淋巴结都有不同程度的肿大;心脏外膜有出血点和出血斑;肾脏变软、瘀血;脑组织水肿，脑血管高度充血，脑膜、脑实质充血，脑积液增多。

根据羊的发病情况、临床症状和剖检的病理变化，初步诊断为由伪狂犬病毒感染所致。

     无菌采集病死羊的脑、肝脏、脾脏等组织病料样品，低温保存并迅速运往青海省海西州德令哈市畜牧兽医工作站兽医实验室。取无菌采集的组织病料样品涂片做革兰氏和瑞氏染色，镜检细菌的有无及形态。取无菌采集的组织病料样品分别接种于鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、厌氧肉肝汤中进行细菌的分离培养与鉴定。组织病料样品染色后，镜检未发现有任何细菌。组织病料样品接种的鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、厌氧肉肝汤均无细菌生长。该结果表明，此次青海山羊发病，不是由细菌感染引起。

     在伪狂犬病毒抗体胶体金试纸条的加样孔内滴加约100μL血清样品，放置10～20min后，若检测线与对照线同时出现紫红色，表示阳性结果，抗体滴度越高，检测线颜色越深。采集发病羊血清10份，伪狂犬病毒抗体胶体金试纸条(深圳市康百得生物科技有限公司)检测结果显示均为伪狂犬病毒抗体强阳性。

     将无菌采集的组织病料样品混合匀浆，加入灭菌生理盐水制成10%悬液，反复冻融3次，12000r/min离心10min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液经背部皮下注射家兔4只，1mL/只，同时取4只兔注射灭菌生理盐水作为对照，隔离饲养，观察7d。结果:注射病料样品的4只健康家兔24h后开始表现出厌食、体温升高、精神沉郁、奇痒等与病死羊完全相似的临床症状。48～96h期间，4只兔全部死亡，剖检攻毒死亡兔，可见脑部、肝脏、肾脏、心脏等实质器官都具有与病死羊相似的病理变化。而注射灭菌生理盐水的4只家兔未表现出任何症状和不适反应。

     主要试剂:病毒基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京九州天瑞科技有限公司;rTaq、dNTP、DNA分子质量标准DL2000Marker购自TaKaＲa(大连)有限公司。

     引物合成:依据相关文献设计合成伪狂犬病毒的1对特异性检测引物，上游引物序列为:5'－TC-CACTCGCAGCTCTTCT－3';下游引物序列为:5'－GCACGTCATCACGAAGGA－3'。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

     组织病料DNA的提取:将无菌采集的组织病料样品混合匀浆，加入灭菌生理盐水制成10%悬液，反复冻融3次，12000r/min离心10min，取上清液，按照病毒基因组DNA提取试剂盒使用说明的操作方法与步骤提取组织病料的病毒DNA。

     PCＲ扩增与检测:以提取的DNA为模板，依据吴发兴等的方法进行PCＲ扩增。PCＲ结束后取5μL扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步进行片段大小的检测。电泳检测表明(如图1所示)，临床组织病料PCＲ扩增产物在位于632bp大小处可见特异性DNA扩增条带，该结果与吴发兴等报道完全一致。

     序列鉴定:按胶回收试剂盒使用说明的操作方法与步骤回收纯化特异性PCＲ扩增产物，将其送北京三博远志生物技术有限责任公司进行序列测定，将测序结果与GenBank中的伪狂犬病毒基因组序列进行同源性比较分析。测序结果表明，其核苷酸序列与GenBank所登录的伪狂犬病毒特异性核苷酸序列同源性均达97.6%以上。

     经伪狂犬病毒抗体检测、家兔接种试验以及病毒核苷酸序列鉴定，确诊为伪狂犬病。

     首先，对发病羊和疑似病羊全部扑杀，尸体进行焚烧、深埋等无害化处理，并对养殖场及周围坏境进行了彻底消毒。其次，对附近所饲养的羊、猪、牛全部进行了伪狂犬弱毒活疫苗的免疫接种。

     近年来，免疫学和分子生物学技术的快速发展，给动物疫病的快速确诊提供了新技术、新方法。此次疫情的实验室诊断采用了胶体金免疫技术和PCＲ技术，且伪狂犬病毒抗体胶体金试纸条的检测结果与伪狂犬病毒抗原PCＲ检测结果完全一致。在实际应用中发现，胶体金免疫层析试纸条简便、快速、特异、敏感、不需特殊仪器、结果判断直观，特别适合于基层兽医部门和养殖场进行快速诊断;PCＲ方法特异性强、灵敏度高、操作简单、快速，且能够检测病原体特异的核苷酸序列，具有常规诊断方法无法比拟的可靠性和准确性。建议其他基层兽医单位推广使用胶体金试纸条和PCＲ检测方法。

     一般绵羊感染伪狂犬病毒后常常表现急性反应，而山羊则表现慢性反应，病程较长。虽然成年山羊感染伪狂犬病毒的病例有过报道，但像此次如此急性的病例较少。近几年来，羊感染伪狂犬的病例有明显增多的趋势。究其原因，笔者认为我国养羊业近几年来发展迅速，日益表现出规模化、集约化养殖模式，而疫病的防控能力还比较滞后，防控意识还有待加强。故建议加强对我国羊伪狂犬病毒的诊断及监控，逐步减轻规模化养殖与疫病防控滞后之间的矛盾，促进我国养羊业健康、迅速发展。

(青海省海西州都兰县香日德镇，吕建军;青海省海西州德令哈市尕海镇，张兰清;青海省海西州德令哈市，英措)