鄂西北地区规模化猪场仔猪腹泻疫情原因分析

周华林 熊江林 张文杰
鄂西北动物疾病诊断中心
襄阳职业技术学院
浙江大学 动物科学学院，
北京世纪元亨动物防疫技术有限公司

    猪传染性胃肠炎、 流行性腹泻和轮状病毒肠炎是猪的高度接触性肠道传染病， 多发生于冬春季节， 呈地方性流行或散发。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、 轮状病毒(PＲV)等病原可通过带毒母猪胎盘和乳汁传播给仔猪，也可通过仔猪间的直接接触经消化道和呼吸道传播。猪致病性大肠杆菌可引起仔猪黄痢、 白痢和水肿病。在临床诊断过程中， 这些引起仔猪腹泻的病原不易区分。上述三种病毒间可呈现混合感染， 或与致病性大肠杆菌混合感染， 能引起 10 日龄以内的仔猪严重脱水， 死亡率高(平均 50%左右， 最高可达 100%)。2011 年 12 月份以来， 鄂西北地区多家猪场仔猪出现水样腹泻、 呕吐和迅速脱水等传染病， 抗生素治疗效果差。为查找病因， 笔者于 2011 年 12 月份—2012 年 6 月份， 对本地区发生严重腹泻的 26 家规模化猪场饲养的猪群进行临床观察、 病理剖检和实验室诊断， 确定本次仔猪腹泻的主要病原是流行性腹泻病毒， 并提出了可行的应对措施。

1材料与方法
1． 1主要试剂及培养基
TGEV、 PEDV、 PＲV qＲT － PCＲ 检测试剂盒， 购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;M． Ｒ． 试剂、V － P 试剂、 微量生化发酵管， 购自杭州微生物试剂有限公司;猪胆盐、 牛肉膏、 蛋白胨， 购自北京奥博星生物技术有限责任公司;革兰染液、 麦康凯培养基、 1%蛋白胨培养基、 靛基质试剂、 三糖铁琼脂培养基、 硫化氢试验培养基， 自制。
1． 2病料
无菌采集典型腹泻仔猪脏器和肠腔内新鲜粪样，3 h 内进行细菌分离和病毒检测。
1． 3流行病学调查
调查发病猪群的免疫情况、 仔猪腹泻流行规律和死亡率。
1． 4临床观察
对腹泻仔猪精神状态、粪便颜色和质地、 体表特征以及体温等临床特征进行详细观察记录。向养殖场有关技术人员询问病死猪死前的一些临床表现。
1． 5病理剖检
对病死猪进行剖检， 重点观察肩前淋巴结、 腹股沟浅淋巴结、 肠系膜淋巴结的外观和质地，心脏、 肝脏、 脾脏、 肾脏的外观和质地， 小肠和大肠的肠壁病变和肠内容物的特征。
1． 6细菌学鉴定
1．6． 1细菌的分离纯化
将无菌采集的病料接种于巧克力培养基和麦康凯培养基， 37 ℃培养 18 ～24 h，观察细菌生长情况、 菌落特征， 并对可疑菌落进行染色、 镜检、 纯化和菌种保存。
1． 6． 2生化鉴定
对所有分离的菌株进行生化试验， 具体操作参照参考文献［ 1］ 进行。
1．6．3动物试验
为了鉴定所分离的菌株是否具有致病性，使用小白鼠进行动物回归试验。每次试验选用 20 只 16 ～20 g 健康昆明系小白鼠(购自襄阳职业技术学院医学院)， 随机分为对照组和试验组。将纯化菌株接种于普通营养琼脂培养基培养18 ～20 h;用无菌生理盐水洗下制成菌悬液(约 20 ×108～50 ×108个/ mL)， 再将菌悬液腹腔注射健康小白鼠(0． 5 mL/只)， 隔离饲养， 观察小白鼠的发病死亡情况。剖检小白鼠， 取病变明显的组织接种于巧克力培养基和麦康凯培养基， 37 ℃培养 18 h， 挑取可疑菌落进行染色、 镜检、 生化鉴定， 观察是否为接种菌株。
1．7病毒学鉴定
1．7．1样本的采集
对新发生腹泻的仔猪， 使用一次性无菌注射器， 吸取无污染新鲜粪便 2 mL;对因腹泻脱水死亡猪只进行解剖， 取肿胀肠系膜淋巴结 2 g，或取半透明充胀小肠肠段 3 cm， 两端结扎。所采样本均装入无菌自封袋， 标号后冷藏， 待检。
1．7．2样本的处理
    组织样品的处理:分别从肠系膜淋巴结的 3 个不同位置取样， 或剪取肠段， 称取样品约 1 g， 用手术剪剪碎， 混匀， 再取 0． 05 g 于研磨器中研磨， 加入1． 5 mL 生理盐水继续研磨， 待匀浆后转至 1． 5 mL 灭菌离心管中， 8 000 r/min 离心 2min;取上清液 100 μL 于 1． 5 mL 灭菌离心管中， 用于病毒ＲNA 的提取。
    粪便样品的处理:取约 0． 05 g 粪便于1． 5 mL灭菌离 心 管 中，加 入 1 mL 生 理 盐 水 涡 旋 振 荡，8000 r/min离心 2 min， 取上清液 100 μL 于1． 5 mL灭菌离心管中， 用于病毒 ＲNA 的提取。
1．7．3病毒实时荧光 ＲT － PCＲ(qＲT － PCＲ)的检测
按照 PEDV、 PＲV、 TGEV qＲT － PCＲ 检测试剂盒的操作规程进行病毒 ＲNA 的提取和 qＲT － PCＲ 扩增检测。
1．7． 4结果判定
    如阳性对照 Ct 值≤35 并出现特定的扩增曲线， 阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线， 试验结果成立;被检样品若 FAM 荧光信号 Ct 值≤35 并出现特定的扩增曲线， 为 TGEV 阳性;若被检样品 VIC 荧光信号 Ct 值≤35 并出现特定的扩增曲线， 为 PEDV 阳性;若被检样品 LIZ 荧光信号 Ct 值≤35 并出现特定的扩增曲线， 为 PＲV － A 阳性;被检样品 36 ＜ Ct≤38 并出现特定的扩增曲线， 需重新再做一次， 如两次结果相同， 则判定为阳性;被检样品 Ct值 ＞ 38 时， 超过本方法检测灵敏度范围， 判定为阴性。

2结果
2．1流行特点
    调查的 26 家猪场均存栏经产母猪 200 头以上，母猪群均在 10 月份一次接种 2 头份国产流行性腹泻和传染性胃肠炎二联疫苗， 猪瘟、 伪狂犬病、 圆环病毒病等常规疫苗按计划进行免疫。调查的规模化猪场仔猪在 11 月份开始陆续发病， 不同猪场仔猪腹泻发病时间长短不一， 持续时间短的为 20 d， 长的为 4 个月或以上， 部分猪场呈现间歇式发病。发病猪场的整栋产仔舍仔猪发生腹泻窝数一般为当月生产窝数的30% ～60%， 呈跳跃式散发。各产仔舍的仔猪发生腹泻时， 窝内传播速度很快， 最初的第 1 只猪发病后12h内即会导致全窝发病。不同生长阶段的猪只均有发病， 日龄越小影响越大， 1 周内新生仔猪发病症状严重， 腹泻 2 ～3 d 就会呈现严重脱水而死亡， 死亡率可达 50%， 最高的死亡率为 100%。少数仔猪恢复后生长不良。断奶猪、 母猪和中大猪常呈现精神萎顿、 厌食、 持续性腹泻和部分猪只呕吐， 大约持续 3 ～7d会自行康复。
2．2临床症状
发病猪只的主要临床症状为水样腹泻， 粪便呈现水泥浆样， 初为灰色或灰黄色， 迅速转为血性水痢， 粪便中混有脱落的肠黏膜或纤维素性渗出物， 异常腥臭。部分腹泻仔猪采食教槽料或猪奶后， 会出现呕吐症状。病猪体温正常或稍高， 精神沉郁， 食欲减退或废绝。持续性的腹泻会导致营养吸收不良， 猪只吮吸力下降， 大大加重新生仔猪的病情。
2．3病理变化
病死猪脱水、 消瘦， 皮肤干燥、 无弹性。解剖可见胃内充满未消化的黄白色乳凝块， 小肠扩张， 外观明亮， 肠壁变薄;肠管内充满黄色液体或充气;小肠黏膜、 肠系膜水肿、 充血， 个别发病仔猪小肠黏膜有轻度点状出血;大肠和盲肠段肠黏膜水肿、 出血、 坏死， 表面附着胶胨状炎症渗出物;肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结出血、 肿胀， 颜色发紫。其他实质性器官未见肉眼病变。

2．4实验室诊断结果(见表 1)
通过细菌学鉴定， 部分猪只腹泻病原为致病性大肠杆菌。通过qＲT－PCＲ检测， 部分猪只腹泻病原为流行性腹泻病毒。另外， 有相当一部分仔猪体内同时分离到致病性大肠杆菌和流行性腹泻病毒。由表 1可知:19 家猪场流行性腹泻病毒检测结果阳性(qＲT － PCＲ 扩增图结果图 1)， 阳性率为 73． 08%。其中 16 家猪场仔猪为猪流行性腹泻病毒并发感染致病性大肠杆菌， 占 61． 54%;3 家猪场仔猪仅为流行性腹泻病毒感染， 占 11． 54%;7 家猪场仔猪腹泻仅为致病性大肠杆菌所致， 比例为 26． 92%;26 家猪场传染性胃肠炎病毒和轮状检测结果均为阴性。由此可见， 本次送检 26 家规模化猪场发生腹泻的主要病原为 PEDV， 且相当一部分猪场仔猪并发感染致病性大肠杆菌， 部分猪场仅为致病性大肠杆菌引起猪只腹泻。

3讨论
    试验结果表明， 引起鄂西北地区规模化猪场仔猪腹泻的病原为 PEDV。同时发现， PEDV 在该地区通常与致病性大肠杆菌混合感染， 引起仔猪的高死亡率。
    自从 PEDV 于 1971 年首次在英格兰被发现来，人们陆续在亚洲和欧洲许多发生腹泻的规模化猪场分离到 PEDV。自 1976 年来， 我国相继报道有流行性腹泻的发生。张世忠等的试验结果表明:福建省 规 模 化 猪 场 2011 年 PEDV 感 染 阳 性 率 为52． 2%;在调查的 96 例病例中， 76． 0%分布于冬春季(11 月份至次年 3 月份)， 19． 8% 分布于春末夏初(4 — 6 月份)， 个别发生于炎热夏季(如 7 月， 10 月份)。刘孝珍等报道了在 2011 年从新疆、 黑龙江、北京、 山东、 河南、 上海、 福建、 广东和广西等分离到PEDV， 与国内以前报道的基因型存在差异， 病毒发生了变异。这些原因导致许多厂家生产的疫苗免疫效果不理想， 流行性腹泻的防控形势严峻。因此， 加强本地区适应性流行性腹泻疫苗的研制和科学合理免疫程序的制订意义重大。

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