小反刍动物兽病疫苗研究进展

1传统弱毒疫苗
1.1RPV弱毒疫苗
与PPRV同为副黏病毒科麻疹病 毒 属 的 还 包 括 牛 瘟 病 毒 （Rinderpest virus，RPV） 、人麻疹病毒 （Measles virus，MV） 、犬瘟热病毒 （Canine distemper virus，CDV） 及海豹瘟病毒（Porpoise distemper virus，PDV） 等。其中，RPV与PPRV的基因和抗原存在高度同源性，且由于早期对研究PPRV弱毒疫苗的尝试失败，因此，早期防控PPR 使用的疫苗是一种针对 RPV 的组织弱毒疫苗(TCRV)[9]。用TCRV免疫后，在免疫动物的血清中只能检测到针对RPV的抗体，而无法检测到针对PPRV的抗体，不过当动物感染PPRV后，针对PPRV的中和抗体逐渐增多，能提供动物足够的保护。这一结果说明，在由诱导的免疫应答对病原进行清除之前，感染的PPRV在动物体内进行了短暂的繁殖。该疫苗在过去很长一段时间内对PPRV的防控发挥了重要作用。但PPRV在动物体内短暂的繁殖期间是否会传播病毒还不确定，存在散毒和毒力反强风险；血清学检测也不能区分自然感染和疫苗免疫的动物；同时随着在全球范围内牛瘟的消灭，该疫苗现已被停用[9-10]。
1.2PPRV弱毒疫苗
1989年，Diallo等将PPRVNigeria75/1株接种于Vero细胞上，连续传代，成功地将Nigeria75/1致弱，研制出第一株PPRV的同源弱毒疫苗。在随后的7年时间里，应用弱毒疫苗Nigeria75/1对98 000多只山羊和绵羊进行免疫保护试验，结果表明该疫苗是安全有效的，保护时间至少持续3年。且在这段时间内，孕羊不会发生流产，接种动物不传播病毒给其他动物[11]。根据PPRV的 F、H 和 N 基因的序列对比，可将 PPRV 归为４个群，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群主要分布在非洲，Ⅳ群只分布在南亚次大陆地区，南亚次大陆地区除了存在Ⅳ群外，还存在主要流行于中东和东非的Ⅲ群[6]。PPRV Nigeria75/1属于PPRVⅠ群，当采用其他不同基因群的PPRV进行攻毒试验时，病毒均不能在体内复制，说明该疫苗可应用于不同地域的PPR防控。至今，弱毒疫苗Nigeria75/1仍是OIE规定的唯一允许使用的PPRV疫苗。我国于2007年7月份首次在西藏地区发生小反刍兽疫疫情，随后，在10月份生产出第一批小反刍兽疫弱毒活疫苗 （75/1株） 用于西藏和新疆部分地区的紧急免疫[1]。印春生等[12]对该疫苗进行了临床应用研究，研究表明该疫苗在田间大规模使用时安全有效，且具有良好的免疫原性和较长的免疫持续性。
    PPRV对热非常敏感，这一特点和其他的副黏病毒一样，这成为在热带疫区使用活毒疫苗最大的障碍。由于这些地区基础设施较落后，很难实现低温运输和保存疫苗。为克服这一障碍，Worrwall等[13]通过添加含海藻糖的稳定剂进行冻干处理，研制出热稳定性冻干疫苗，该疫苗能够在45 ℃条件下保存14 d。这种热稳定性疫苗对PPR的防控起到了很大的作用。有相关报道称，重水也可以使PPRV疫苗热稳定性提高，用含重水的稀释液氘化后，疫苗可维持更高的滴度。
    2010 年，印度当地的流行毒株 Sungri96 株、Arasur87株和Coimbatore97株通过在Vero细胞上连续传代制备成Sungri96弱毒株、Arasur87减毒株和Coimbatore97减毒株。动物试验结果显示，这些弱毒株和减毒株对山羊及绵羊的保护作用是安全有效的。
虽然小反刍兽疫弱毒疫苗无副作用，能交叉保护各个群毒株的攻击感染，很好地预防小反刍兽疫的发生，但弱毒疫苗热稳定性差。而且该疫苗最大的缺点是无法从血清学上区别疫苗株和野毒株的感染，这就造成了无法在接种疫苗地区进行血清学调查，使该地区小反刍兽疫的流行病学和相关研究无法进行。此外，由于小反刍兽疫和牛瘟在血清学上有交叉反应，这也就影响了该地区牛瘟血清学调查。

2基因工程疫苗
2.1重组亚单位疫苗
麻疹病毒属的表面糖蛋白具有良好的免疫原性，无论是H或N基因，表达出的蛋白均可作为有效的亚单位疫苗，都能刺激机体产生体液和细胞免疫，产生的抗体可以中和PPRV[15]。基于PPRV及RPV弱毒疫苗间存在交叉中和及交叉保护作用，Jones等[10]构建载体表达了RPV的H和F蛋白，免疫山羊后，虽然产生的抗体只针对RPV，但可对RPV及PPRV产生完全的保护力，同时可通过对抗体的检测来鉴别PPRV疫苗株、感染株及RPV。
2.2嵌合体疫苗
嵌合体疫苗是用PPRV单独或多个糖蛋白基因替代 RPV 基因组中相应的糖蛋白基因。这种疫苗不仅可以对PPRV产生完全的保护力，而且免疫动物血清中无特异的RPV ELISA抗体，排除了疫苗免疫对RPV的血清学干扰。据相关研究表明，用PPRV的F和H蛋白基因单独或二者同时替代RPV疫苗基因组中的相应蛋白基因，这种嵌合体疫苗不仅安全高效，而且具有标记疫苗的优点，可用ELISA方法将自然感染和免疫动物进行鉴别[16]。嵌合体疫苗为PPRV疫苗的研制提供了新的方向。
2.3活载体疫苗
目前，PPRV活载体疫苗尚未得到大量研究。但目前使用的疫苗均为弱毒疫苗，存在安全隐患，因此，活载体疫苗的发展前景被研究者们看好。Berhe 等[17]以羊痘病毒为活载体，将PPRV的F基因插入其TK基因编码区内，构建了重组羊痘病毒疫苗。用该疫苗对动物进行免疫后攻毒，结果显示当免疫量为0.1 CFU时即可起到抵抗PPRV强毒的攻击，同时也能预防羊痘病毒的感染。
2.4核酸疫苗
研究PPRV核酸疫苗具有十分现实的意义。用核酸疫苗进行免疫类似于自然感染，将抗原以自然方式呈递于免疫系统，不涉及抗原表位的变化，可诱导产生有效的体液和细胞免疫，同时核酸疫苗安全可靠、生产方便、成本低廉。Seth等构建了PPRV H基因的真核表达载体，并在动物细胞内进行表达，获得了具有生物活性的PPRV H蛋白[18]。国内也有研究者构建了包含PPRV F和H基因的3种真核表达载体，将3种重组质粒转染真核细胞后均成功表达。将3种重组核酸疫苗免疫山羊并进行特异性抗体检测，发现于第4周抗体水平达到峰值，与在第3周达到抗体峰值的弱毒疫苗相比，重组核酸疫苗抗体水平明显较高。以上研究为PPRV核酸疫苗的正式研制奠定了重要的试验基础[10]。与其他疫苗等相比，核酸疫苗有以下特点：核酸疫苗不存在毒力返强和散毒的危险；免疫应答持久；制备简单、省时省力；不受母源抗体干扰。虽然核酸疫苗优点显著，但毕竟其研究与发展的历史比较短暂，不可避免存在着许多的问题，如有效目的基因的选择问题、完美载体的构建问题、目的基因的高效表达问题、应用对象问题、安全性问题、免疫耐受性问题、抗原进入机体后表达难以调控问题和污染问题等，这些都是核酸疫苗发展尚待解决的问题。
2.5植物疫苗
植物疫苗作为一种口服疫苗在防控PPR方面具有十分广阔的应用前景。与传统疫苗相比，植物疫苗具有以下优势：
①生产成本低；
②易于保存；
③具有天然的免疫原性；
④免疫途径更加安全；
⑤免疫途径更加有效；
⑥易于推广。
Khandelwal A等应用基因工程的方法在花生植物中表达了PPRV H蛋白，获得的H蛋白不但具有生物活性，而且其抗原表位具有天然构象。以该花生植物的鲜叶饲喂山羊后，在山羊体内激发了抗H蛋白的特异性细胞免疫。今后随着研究的不断深入，应该会有更多用于PPR防控的植物疫苗问世。

3  RNA 干涉技术
RNA 干扰技术近年来迅速兴起，其前景被普遍看好。它是指由双链RNA启动的序列特异的转录后的基因沉默现象[20]。研究显示，向生物体内注入微小RNA片段，会干扰生物体本身的RNA“信使”功能，导致相应蛋白质无法合成。采用RNA干扰技术直接从源头上让致病基因“沉默” ，也许可以更有效地防控或治疗某些疾病[21]。已有专利发明表明，用于治疗和/或预防小反刍兽疫的siR-NA片段及包含该siRNA片段的载体均对PPRV感染的Vero细胞系有保护作用，通过实时定量PCR和免疫印迹试验发现该siRNA片段及包含该siRNA片段的载体能使PPRV-L蛋白mRNA水平降低约20%～40%，说明siRNA片段及包含该siRNA片段的载体可用于制备治疗和/或预防PPR的药物[22]。因此小干扰RNA分子有望发展为防控PPRV的潜力制剂。

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