影响禽流感病毒致病性和传播的关键氨基酸位点的研究进

徐晓龙，包红梅，陈化兰，王秀荣
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
兽医生物技术国家重点实验室
农业部动物流感重点开放实验室

    A型流感病毒根据其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为不同亚型，目前已鉴定出有 17 种 HA 亚型和10 种 NA 亚型。禽流感(Avian Influenza，AI) 是由 A 型流感病毒引起的急性或慢性呼吸道传染病，根据临床症状不同 划 分 为 高 致 病 性 禽 流 感 (Highly pathogenic avianinfluenza，HPAI)和低致病性禽流感(Low pathogenic avianinfluenza，LPAI)。HPAI 以急性死亡、高致死率和传染性强为特征，被 OIE 列为需要实时通报的传染病。禽流感病毒(AIV)为分节段的负链 RNA 病毒，由 8 个基因节段组成，其基因组编码 11～12 种蛋白质，包括结构蛋白：HA、NA、基质蛋白(M1)、离子通道蛋白(M2)、聚合酶复合体(PB1、PB2 和 PA)，核蛋白(NP)，核输出蛋白(NEP，即 NS2)；非结构蛋白：NS1、PB1-F2。
哈尔滨兽医研究所首次在国内分离到 H5N1 亚型HPAI 病毒(HPAIV)后，香港发生 H5N1 亚型 HPAIV 感染并导致人死亡的事件，为全球首例 AIV 突破种间屏障直接感染人的现象。一般认为，AIV 感染人类是由不同亚型AIV 经猪体混合而得以重组，获得结合人类呼吸道细胞的能力。研究表明，该次流行病毒株似乎未经过重组，而是部分氨基酸位点的突变导致病毒跨种间传播及致病性增强。本文就影响 AIV 致病性及传播的关键氨基酸位点进行如下综述。

1 HA与AIV致病性和传播的关系
    HA是AIV 囊膜纤突的主要成分，其主要功能是结合宿主唾液酸类细胞受体，辅助病毒吸附宿主细胞，完成内吞和脱壳。HA 的影响主要体现在以下两个方面。
1.1 HA裂解位点处氨基酸序列对致病性的影响
    AIV借助 HA 吸附于细胞膜，引起感染，其多个碱性氨基酸裂解位点对 AIV 致病性起着决定性作用。病毒囊膜与细胞膜融合时 HA 蛋白裂解为 HA1 和 HA2，HA 的裂解位点不同影响了流感病毒的组织嗜性。HPAIV 的 HA 裂解位点处存在连续 4 个以上碱性氨基酸(-RRRR-)，可以被多种蛋白酶所裂解，使其感染宿主并在不同组织细胞中增殖，进而导致宿主的全身感染甚至死亡，而 LPAIV 在 HA 裂解位点中一般只有单个碱性氨基酸(-R-)，这种结构的 HA 蛋白只能被存在于呼吸道和消化道内的精氨酸特异蛋白酶识别并裂解，因而病毒增殖只发生在呼吸道和消化道等局部，从而导致温和性感染。
1.2 HA蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
    香港流感患者体中分离到的 AIV，HA 蛋白 226 位点突变为 M 后，HA 蛋白对唾液酸 α-2，3- 半乳糖及唾液酸 α-2，6- 半乳糖均具有结合能力，这也是 AIV 可以直接感染人的原因之一[1]。进一步研究表明 AIV 的 HA 蛋白第 226 位氨基酸起关键作用，HA 蛋白 226 位常为 Q，228 位常为 G，而人流感病毒 226 位为 L，228 位为 S，如 226 位为 Q 和228 位为 G，则易与唾液酸 α-2，3- 半乳糖结合，若 226位为 L 和 228 位为 S 则易与唾液酸 α-2，6- 半乳糖结合。该发现有助于进一步研究 AIV 突破种间屏障直接感染人的机制。
1.3 H A 蛋白中氨基酸位点对传播的影响
    HA 能够识别α-2,3 半乳糖连接的唾液酸(SAα-2,3-Gal)和 α-2,6 半乳糖连接的唾液酸(SAα-2,6-Gal)两种类型受体[2]。人的上呼吸道上皮细胞表面主要含有 SA-2,6-Gal，而在禽类呼吸道细胞及马的气管和鸭的肠道主要含有 SA-2,3-Gal，人流感病毒与 SAα-2,6-Gal 受体结合，AIV 则易与 SAα-2,3-Gal 受体结合，这一生物学特性形成了人 - 禽流感之间的种间屏障。通过病毒 A/DK/GX/35/H5N1 对豚鼠水平传播能力的影响研究显示，当 HA 发生 A160T 点突变时，病毒由同时识别 SAα-2,3-Gal 和 SAα-2,6-Gal 受 体 转 变 为 只 能 识 别SAα-2,3-Gal 受体，受体结合特性的变化导致该病毒不能在豚鼠间水平传播[3]。目前 HPAIV 还不能在人类之间传播，Imai 等利用 H5HA/H1N1 重组病毒，发现 N158D、Q226L、N224K 和 T318I 4 个位点的同时突变使得病毒具有在雪貂之间传播的能力[4]，还有研究表明在雪貂间可以通过空气传播的 H5N1 病毒其 H103Y、T156A、Q222L 和 G224S 4 个位点发生了突变[5]。最新发现为控制 AIV 在人类之间大肆传播具有重要意义(表 1)。

2 NA蛋白中氨基酸位点对致病性和传播的影响
    NA是AIV 囊膜上除 HA 之外的另一种重要糖蛋白，在病毒吸附宿主细胞时，能够识别细胞受体末端的唾液酸残基并介导病毒进入细胞。Hulse 等利用反向遗传技术以A/CK/HK/YU562/01/H5N1 的 NA 基因替换 A/GD/HK/437-10/99/H5N1 的 NA 基因，显示重组病毒对鸡的致病性明显增强，表明 NA 蛋白对病毒的致病性具有较大影响[6]。NA 的颈部是连接头部的酶活性中心和跨膜结构域以及细胞质结构域的一段结构。研究表明，NA 颈部的长度与病毒跨种传播和致病力相关。近年研究表明 H5N1 病毒中 NA 颈部 48～69 位缺失的分离率呈现逐年增长趋势，而且短颈 NA 的 H5N1 病毒更易于表现高致病性。因此，推测这种缺失模式的短颈 NA 可能是水禽 AIV 传播到陆生家禽，并对其逐渐产生适应性的一个重要分子标记。

3 聚合酶复合体与 AI V 致病性和传播的关系
    AIV 聚合酶复合体由 PB1、PB2 和 PA 组成，3 种蛋白以非共价键紧密结合形成异源三聚复合体，共同行使病毒 RNA 的转录和复制功能。
3.1 PB1 蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
    PB1 蛋白具有聚合酶活性，其功能是在病毒 mRNA 合成起始后使之逐渐延长。此外，PB1 蛋白上的某些氨基酸位点能够影响 AIV 的致病性。在 A/AH/2/05/H5N1 和 A/CK/SC/81/05/H5N1 两株模式病毒株背景下，Zhong 等发现 PB1 蛋白S622G 和 V709I 的突变，在很大程度上增强病毒对模型小鼠的致病性，同时反方向的突变也能够极大地减弱病毒的致病性，两个位点同时突变作用则更加明显。
2001 年研究表明，在大部分甲型流感病毒中从 PB1基 因 的 +1 阅 读 框 (ORF) 开 始 翻 译 产 生 新 的 病 毒 蛋 白(PB1-F2)，该蛋白定位在线粒体，并通过两个线粒体蛋白的相互作用诱导细胞凋亡[9]。研究表明，H5N1 亚型病毒PB1-F2 蛋白的 66 位 S 与 N 相比，S 对鼠的致病性更强。当 PB1-F2 蛋白发生 S66D 突变时，病毒的致病性减弱，表明 PB1-F2 蛋白也是影响 AIV 致病性的重要因子[10]。还有研究表明，PB1-F2 蛋白与 PB1 蛋白相互作用，能够影响蛋白在细胞核和细胞质的分布，这也可能影响 AIV 的毒力。
3.2 PB2 蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
    PB2 亚基能够识别细胞 mRNA 的 5' 端的帽子结构，并具有 3'-5' 的核酸内切活性。研究显示 PB2 基因能够影响流感病毒的宿主范围。Subbarao 等将分离到的 1 株 AIV 的 PB2 基因和人流感病毒的另外 7 个基因进行重组获得 1 株重组病毒，对其进行生物学特性分析发现，禽源的 PB2 基因改变了人流感病毒的宿主范围，进一步研究显示，PB2 的627 位氨基酸在 A 型流感病毒宿主范围中起决定作用。Hatta 等应用反向遗传学技术对 A/HK/483/97/H5N1(对小鼠致病)和 A/KH/486/97/H5N1(对小鼠不致病)病毒研究，表明 PB2 蛋白是导致这两株 H5N1 亚型 AIV 对小鼠产生致病性差异的关键因素，进一步通过定点突变表明 PB2 蛋白的 E627K 突变增强了 A/HK/486/97/H5N1 对小鼠致病性。另有研究显示 PB2 蛋白 701 位点的 N 对于 AIV 跨越物种屏障感染小鼠并在小鼠体内进行复制起到重要作用。Gao 等证明 PB2 蛋白 701 位点的 N 是 AIV 在豚鼠体内复制所必需的。PB2 蛋白上其他氨基酸位点同样对致病性具有影响，有报道 PB2 蛋白 E158G 突变能够增强病毒 RNA聚合酶在人体细胞中的活性，而且 PB2 的 E158G 突变能够显著增强 AIV 在小鼠组织中的复制能力。除了单一蛋白上关键氨基酸位点的影响，不同蛋白间以及同一蛋白不同氨基酸位点的联合突变对致病性的影响也受到广泛关注。研究发现 H1N1/2009 病毒株 PB2 蛋白中 A271T 的突变可使 AIV 在豚鼠中通过飞沫传播的能力丧失，若该突变与 HA 蛋白 Q226R 突变一起作用则可使AIV 在雪貂中飞沫传播的能力丧失。该研究为人类进一步研究 AIV 致病分子机制提供了新的思路和实验依据
3.3 PA蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
    PA蛋白是一种磷酸化蛋白，对聚合酶的结构起着重要的作用，PA蛋白的功能尚不清楚，定点突变表明 PA 蛋白能够影响AIV 的 转 录 和 复 制 。 Song 等 将 A/Goose/HB65/H5N1 和A/Duck/HB49/H5N1 两株病毒定点突变，表明 PA 蛋白 224和 383 位氨基酸是影响病毒对家鸭致病性的关键位点，证明 PA 蛋白是影响 H5N1 亚型 AIV 对家鸭致病性的主要因素，但具体的机理需要进一步的研究确定。

4 NS蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
    NS1 蛋白是 AIV 一个重要的毒力因子，具有多种功能，它可以干扰 mRNA 前体的剪切、polyA 的形成以及干扰细胞 mRNA 从细胞核进入细胞质。同时 NS1 蛋白中关键氨基酸位点的变化能够使 AIV 对自然免疫产生拮抗作用 。有报道NS1蛋白S42P突变会显著增强A/Duck/Guangxi/12/03/H5N1 在小鼠中的致病力，然而在同样的位置以 S 代替 P 将减弱 A/Duck/Guangxi/27/03/H5N1 的毒力，进一步研究表明 NS1 蛋白中第 42 位的 S 不仅是 H5N1 病毒对抗宿主细胞干扰素诱导的关键，也是 NS1 蛋白防止双链 RNA 介导的 NF-kB 通路和 IRF-3 通路激活的关键。NS2 蛋白主要功能是转运病毒复制产生的核糖核蛋白体(vRNP)从细胞核到细胞质，同时 NS2 蛋白含有核输出信号，能够与核穿孔复合体中某些蛋白相互作用，介导M1-RNP 复合体穿过核膜。目前 NS2 蛋白中关键氨基酸点位对病毒致病性的影响还有待研究。

5 NP蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
    NP 蛋白为核蛋白，是病毒粒子主要的结构蛋白，为AIV 中诱导宿主细胞免疫应答的主要成分。NP 蛋白在体内和体外均能够与病毒聚合酶复合体中的 PB2 和 PB1 相互结合，但并不与 PA 相结合，同时其能够与 M1 蛋白相互作用从而影响病毒粒子的出芽过程。Tada 等发现 NP 蛋白 Ile109Thr 的突变能够促进病毒 RNA 的合成，增强 AIV对鸡的致病力[19]。推测该突变可能改变 NP 蛋白构象，影响其与 PB1、PB2 以及转录因子之间的相互作用。但 NP蛋白对病毒致病性的影响具体机制，以及它与病毒其他蛋白的功能关系尚不清楚。

6 M蛋白中氨基酸位点对致病性的影响
     AIV 的 M 基因编码 M1 和 M2 蛋白。M1 为维持病毒形态的基质蛋白，介导病毒粒子出芽和装配过程；M2 蛋白装配于囊膜上作为跨膜离子通道蛋白。研究表明，当M1 蛋白的 N30D 和 T215A 发生突变时，A/duck/Fujian/01/2002/H5N1 在 小 鼠 体 内 表 现 出 高 致 病 性 ， 而 A/duck/Guangxi/53/2002/H5N1 则为较低的致病性，由此证明 M1蛋白中相关氨基酸位点的突变是导致两者对小鼠致病性产生差别的关键。
AI不仅对养禽业危害严重，同时还具有重大公共卫生学意义。因此，加强致病机制研究和加强对 AIV 的监测和评估，是控制 AIV 疫情的基本措施。大量研究数据表明 AIV 的致病性是多因素相互作用的结果，并且与病毒本身和宿主特性有关。HA 蛋白裂解位点处的连续碱性氨基酸和与唾液酸受体结合的能力能够影响 AIV 的宿主范围，NS1 蛋白主要涉及影响宿主干扰素的调控，提高致病性，PB2 蛋白也能够影响宿主的范围以及促进病毒在宿主体内的复制。目前对 HA、PB2 及 NS1 这 3 种蛋白的影响机制研究较为深入，关于其他蛋白对病毒致病性影响机制目前尚未得到明确统一的结果，这方面的研究将受到更多关注，成为影响 AIV 致病性和传播的关键氨基酸位点研究领域的新突破点。

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