猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展

王林青 郑兰兰 李坤 陈红英 李文增 李坤陶 崔保安
河南农业大学 牧医工程学院
郑州师范学院 生命科学系
河南省动物性食品安全重点实验室

    猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又名猪疱疹病 毒 I 型 (Suid herpesvirus type I)， 属 于 疱 疹 病 毒 科(Herpesviridae) 甲 亚 科 (Alphaerpesvirinae) 水 痘 病 毒 属(Varicellovirus)，为线状双股 DNA 病毒，全长约 150 kb，含有 77 个读码框，平均 G+C 含量高达 73.6 %。PRV 由独特的长区段(UL)和短区段(US)及位于 US 两侧的末端重复 序 列 (TR) 和 内 部 重 复 序 列 (IR) 所 组 成 ， 即 形 成 了UL-IR-US-IR 结构。
    UL 区主要基因有 gB、gC、gH、gK、gL、gM、gN、TK(胸苷激酶)等；US 区的基因有 gD、gE、gG、gI、蛋白激酶(PK)基因、11 ku 和 28 ku 蛋白基因。病毒增殖的必需糖蛋白主要有 gB、gD、gH、gL、gK；非必需糖蛋白主要有 gC、gE、gI、gG、gM、gN 等，这些在病毒与细胞的相互作用、病毒感染的病理过程和免疫原性中具有特殊作用。TK、gE、gI 基因决定 PRV 的毒力，为重要的毒力因子。TK 基因的缺失显著降低病毒毒力，但不影响病毒的增殖，是外源基因插入的首选位点[1]。PK 基因的缺失导致毒力下降，但不影响 PRV 的免疫效力。除 gG在感染细胞过程中大量产生并分泌至培养基中，常存在于感染细胞分泌物中，其他糖蛋白均为病毒囊膜的成分。目前，以 PRV 作为活病毒载体构建的基因缺失疫苗株通常为缺失 gE、gI、gG、gC 及 TK 等非必需基因，也有缺失 gD 或 PK 基因的报道。PRV 已成为重组病毒载体领域的热点之一，具有良好的应用前景。现就以 PRV 为载体研制重组疫苗的研究进展作以综述。

1 PR V 载体的构建
     简单高效地将外源基因插入到 gD 基因位置构建gD-PRV 载体的方法只需两步。首先，将单纯疱疹病毒(HSV) TK 基因插入到 TK-/gE-双缺失 PRV 的 gD 基因位置，在 HAT 培养基上可以筛选获得 gD-/ HSV-TK+突变株。然后，以目的基因取代 HSV-TK 基因，gD/gE/TK 3基因缺失株则很容易通过阿昔洛韦筛选而得到分离。插入的外源基因可以在体内表达外源蛋白，并能够诱导机体产生抗 PRV 和外源保护性抗原的抗体，抵抗 PRV 致死性攻击。这种携带不同保护性抗原基因的 PRV 载体可以方便地用来构建多价疫苗。
    增强型绿色荧光蛋白(eGFP)作为筛选标记，在重组PRV 构建方面得到广泛应用。表达 eGFP 的重组 PRVgG/M1 接种 PK-15 细胞，在感染早期(6 h)则可以观察到荧光，随着病毒的增殖(24 h～36 h)，荧光逐渐增强，直至完全病变，荧光淬灭。绿色荧光也可以作为活细胞示踪实时监测病毒感染的动态分析。eGFP 作为报告基因的通用转移载体 TK-/gG-/lacZ+、以 GFP 作为筛选标记的 PK 和gG 基因双缺失的疫苗株和稳定表达 IacZ 基因的 PRVgE/TK 基因缺失突变株的构建均有报道。
    将 Cre/loxP 系统应用于 PRV 重组研究，在 PRV 基因组中引入 loxP 位点，构建含单个 loxP 位点的 PRV TK 基因缺失株，为构建全长的 PRV 细菌人工染色体(BAC)奠定了基础。苏鑫铭等构建了稳定表达 Cre 重组酶的293A-Cre 细胞系，可以用于含有 loxP 位点的 PRV 基因组中快速删除或整合外源基因[5]。利用同源重组在 BaghaK61 株的 TK 基因中插入 BAC 质粒和 GFP 筛选标记，获得带有 BAC 质粒的 rv-PRV BAC，在细胞培养中重组病毒的增殖速度与亲本株无明显差异，GFP 能够稳定表达并且稳定遗传，为进一步开展 PRV 的细菌人工染色体的构建奠定了基础。
    受接合辅助遗传整合克隆(Mating-assisted geneticallyintegrated cloning，MAGIC)技术的启发，蒋思靖等以RV-BAC pBecker2 为基础，建立了高通量构建重组 PRV载体的方法。通过细菌的接合介导克隆目的 DNA 片段的供体质粒，供体质粒由供体菌转移到受体菌中，在Red-gam 重组酶介导下，两者发生同源重组。该方法避免了 DNA 的体外操作，但不会引入额外的 DNA 序列，简化了实验步骤。使用小载体克隆 DNA 可以通量化构建供体载体。为避免离体操作对 BAC 化 PRV 基因组的损伤，从而建立利用大肠杆菌感染介导 PRV-BAC DNA 转入动物细胞，获得重组病毒的方法；这两种方法结合使用，从基因克隆到获得重组病毒仅需要 7 d，简化了重组 PRV 的构建流程，提高实验效率，降低成本，适宜大规模操作。

2重组疫苗的构建
2.1狂犬病毒(R V )/ PR V 重组疫苗
    Yuan 等构建了表达RV 糖蛋白膜外区的重组 PRV (rPRV)，将其接种犬 5 周后，体内 RV 中和抗体滴度可以维持 6 个月以上；表达RV 糖蛋白全基因的 rPRV/eGFP-rgp，可以有效地刺激免疫犬产生体液免疫和细胞免疫。抗 RV 的中和抗体水平在 l4周时仍保持相对国际最低保护标准较高的水平，并且抗RV 和 PRV 的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平。免疫后第 4 周时，其产生的中和抗体的平均水平高于只表达 RV 糖蛋白膜外区的 rPRV 的中和抗体水平。反向表达 RV 糖蛋白的重组活载体疫苗，外源基因也在细胞内得到了有效表达，并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性[8]。以 PRV TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株，表达 RV 糖蛋白的重组 PRV gG 基因缺失的重组病毒也有报道。
2.2乙 型 脑 炎 病 毒 (JEV )/ PR V 重 组 疫 苗
    表 达 JEVSA14-14-2 株非结构蛋白 NS1 基因的 rPRV TK-/gG-/NS1+，能够表达具有生物活性的 NS1 蛋白，可以作为猪乙型脑炎与伪狂犬病双价基因工程疫苗株。该重组病毒免疫小鼠、断奶仔猪和妊娠母猪均具有良好的安全性，免疫的小鼠能够抵抗 PRV Ea 株的致死性攻击，免疫的断奶仔猪能够产生 PRV 特异性抗体和 JEV 特异性 CTL 活性[10]。表达JEV PrM 基因的重组 PRV TK-/gG-/PrM 和表达 PrM/E 基因重组 PRV TK-/gG-/FrM/E+，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础[11]。
2.3猪流感病毒(SI V )/ PR V 重组疫苗
    倪建强等构建了表达 SIV HA 基因的 rPRV-HA，接种细胞后能够稳定表达HA，并且建立了两种可以区分重组病毒疫苗和 PRV 及SIV 自然感染的鉴别检测方法：一种是利用 SIV 的保守蛋白 NP 建立琼脂扩散试验方法，另一种是利用重组病毒缺失 gE 基因的特性建立 gE-ELISA 方法[2]。将 rPRV-HA 滴鼻免疫小鼠，可以保护其免受 SIV 攻击[12]；将其免疫小猪后 7 d 可以检测到高滴度抗 SIV 的 HI 抗体，而所有对照组仔猪仅在以同亚型 SIV 攻毒后 7 d 才开始产生抗 SIV 的HI 抗体；rPRV-HA 免疫组在病理学保护方面明显优于对照组。攻毒后 7 d rPRV-HA 免疫组未检测到病毒，而两个对照组均可以检测到病毒。表明 rPRV-HA 免疫猪对同亚型 SIV 的攻击具有良好的保护作用[13]。李敏等构建的共表达 H1N1 和 H3N2 亚型 SIV HA 基因的 rPRV，在 Vero 细胞中有效表达，并且所表达蛋白具有免疫原性。
2.4猪繁殖与呼吸综合征病毒(PR R SV )/ PR V 重组疫苗
     表达 PRRSV GP3 基因的 rPRV，不仅不影响 PRV 的增殖以及强弱毒的鉴别，而且能够优化 PRV 弱毒疫苗株，有助于预防 PR 和 PRRS。
     表达 PRRSV GP5 基因的 rPRV-GP5 免疫绵羊，可以完全抵抗 103LD50PRV 强毒 S 株的攻击；免疫仔猪，能够产生抗 PRRSV 的回忆性免疫应答。对健康仔猪肌肉和鼻腔接种及攻毒后显示，rPRV-GP5 是安全的疫苗，为抵抗PRRSV 引起的临床疾病能够提供明显的保护。构建含有PRRSV ORF5 基因的 rPRV TK-/gG-/GP5+，免疫小鼠后产生的抗体水平并不高；改用修饰的 ORF5 基因构建了表达PRRSV GP5m 蛋白的 rPRV TK-/gG-/GP5m+，结果显示能够表达具有活性的 GP5m，免疫小鼠后不仅产生较高水平的抗 PRRSV 中和抗体，而且在诱导 PRRSV 特异性细胞免疫方面也显著优于 TK-/gG-/GP5+[2]。以弱毒 PRV 为载体，在不同形式上表达 PRRSV 两种主要膜蛋白 GP5 和 M，获得4 个重组病毒免疫小鼠后均能够产生 PRV 特异性体液免疫反应，并对致死剂量的 PRV 攻击产生完全保护。其中免疫 rPRV-GP5m-M 的小鼠体内产生了最高水平的特异性中和抗体和淋巴细胞增生应答[16]。
     赵武等以牛疱疹病毒 1 型(BHV1)VP22 蛋白为免疫增强佐剂分子，通过同源重组构建了 2 个 rPRV：共表达BHV1 VP22 和 PRRSV E 及 M 蛋 白 的 rPRV TK-/gE-/VP22E+/VP22M+和表达 BHV1 VP22 与 PRRSV ORF5m 基因的 rPRV TK-/gE-/VP22GP5+。结果显示均能够在体外有效表达融合蛋白，免疫小鼠后可以诱导产生更高的体液免疫与细胞免疫反应。BHV-1 VP22 可在一定程度上增强 rPRV的免疫反应，发挥了佐剂效应。
将高致病性 PRRSV (HP-PRRSV) HuN4 株 GP5 基因和含 eGFP 基因插入到 PRV 通用转移载体中，获得了稳定表达 eGFP 的重组病毒 rPRV-HPGP5，为 HP-PRRS 基因工程疫苗的研究奠定了基础[17]。
2.5猪圆环病毒Ⅱ型(PC V2)/ PR V 重组疫苗
    表达 PCV2ORF1 和 ORF2 融合蛋白的 rPRV-PCV2 免疫小鼠后，小鼠产生了抗 PRV 和抗 PCV2 特异性抗体，并可以抵抗 PRVEa 强毒株的致死性攻击；将其免疫猪后，可以有效的诱导抗 PRV 和 PCV2 免疫反应[2]。表达 PCV2 ORF2 基因的重组病毒 rPRV TK-/gE-/ORF2+，免疫 4 周龄仔猪后，可以诱导机体产生抗 PRV 和 PCV2 的体液免疫反应，并且第49 d 仍能够检测到 PCV2 特异的淋巴细胞增殖反应。共表达 PCV2 ORF2 和 GFP 基因的重组 PRV 株 SA215(C)，能够表达具有活性的 ORF2 基因编码蛋白和荧光蛋白，具有很好的免疫原性。免疫小鼠后，可以诱导小鼠产生抗 PCV2 和 PRV 抗体，并出现 PCV2 的细胞免疫反应，抵抗 PRV Fa 和 PCV2 强毒的攻击[19]。朱前磊等将 IL-2 作为免疫佐剂构建了共表达 PCV2 ORF2 基因和猪 IL-2 基因的 rPRV。
2.6猪细小病毒(PPV )/ PR V 重组疫苗
    吕建强等构建了含 PPV VP2 基因的 rPRV TK-/gG-/VP2+，其表达的 VP 蛋白与 PPV 阳性血清发生反应，而且可以自行装配成病毒样颗粒，VP2 基因的插入不影响重组病毒的增殖特性。罗燕等构建了表达 PPV VP2 基因的重组病毒 SA215(B)，具有良好免疫原性，可以用于预防猪 PPV 和 PRV。免疫仔猪后，抗 PPV 的 HI 抗体最高达 1∶24，抗 PRV 的半数保护量(PD50)最高达 1∶214，可以作为猪 PPV-PRV 二价重组疫苗候选株。SA215(B)在细胞培养方面具有泛嗜性，以 Vero 和 MDBK 细胞最敏感。重组疫苗接种新生仔猪、断奶仔猪和妊娠母猪均安全；重组活疫苗在体内传播扩散能力降低，与强毒相比潜伏感染的可能性降低[2]。表达 PPV VP2 基因的转移载体 pPR-VP2 和表达 GFP 的 PRV与 PPV VP2 基因的重组病毒的构建，也为研制基因工程二价疫苗奠定基础。
2.7猪瘟病毒(C SFV )/ PR V 重组疫苗以TK、gE 和11K
    基因缺失减毒 PRV 作为活载体，将 CSFV 的囊膜蛋白 E2基因与 PRV 启动子融合，构建的重组病毒能够使猪抵抗PRV 和 CSFV 两种强毒的攻击。表达 E2 的 gE 和 gD 双基因缺失重组病毒，能够使猪同时获得抵抗 PRV 和 CSFV两种强毒致死攻击的保护；gD 基因缺失阻止了感染性PRV 的产生，彻底解决了重组病毒的生物安全性问题，但这种重组病毒的保护效果不理想。将以 gG 为启动子，SV40 poly A 为加尾信号的 CSFV E2 表达盒插入 PRV TK基因中，构建表达 CSFV E2 基因和 GFP 基因的 PRV 双基因转移载体 pTKE2，结果在 BHK21 细胞中 E2 和 GFP 基因均获得表达，不引起细胞毒性。含 GFP 和 CSFV E2 基因的 PRV TK 基因缺失转移载体也有构建[2]。徐志文等获得了含 HCV E2 基因的 PRV 重组病毒SA215(A)，该病毒株可以适应 Vero、BHK21 和鸡胚成纤维细胞等多种细胞，但对不同细胞系存在一定的差异。该病毒株具有良好的免疫原性，接种猪能抵抗 PRV Fa 强毒株和 CSFV SM 株两种病毒的攻击，是一株优秀的猪瘟和猪伪狂犬病二价疫苗候选株[21]。
2.8口蹄疫病毒(FM D V )/ PR V 重组疫苗卜春玲等筛选
    出表达 FMDV 结构蛋白 VP1 的 TK－重组病毒[22]。Qian等将 gG 启动子控制下的 FMDV 的 VP1 基因插入 PRV 基因组中的 gG 基因的 N 端下游，获得重组病毒 PRV-VP1[10]。金梅林等构建了表达 FMDV P1 基因的重组 PRV TK-/gG-/PgG-P1，P1 基因在重组 PRV 中得到表达[23]。表达 FMDV 衣壳蛋白前体 P1-2A 基因和蛋白酶 3C 基因的 rPRV TK-/gE-/P1-2A-3C，增殖滴度与亲本株相当，免疫小鼠后，可诱导机体产生明显的免疫反应[2]；PRV-P12A3C 疫苗株免疫仔猪，能诱导产生高水平的中和抗体和 FMDV 特异的淋巴细胞反应。
将含有 CMV 启动子，FMDV P1 基因和 SV40 polyA序列的表达盒插入到弱毒活疫苗株(TK-/gE-/LacZ+) gG 基因中，获得重组病毒 PRV-P1，与商业用 FMD 疫苗相比，PRV-P1 免疫组的猪体内能够诱导高水平的抗 FMDV 和PRV 的中和抗体，激活强的抗 FMDV 的 CTL 反应，抑制FMDV 复制的效率也显著增强。但这种二价疫苗不能以PRV gE-ELISA 方法来检测，限制了其临床应用。将含FMDV 6 个潜在 B 细胞抗原决定簇和 2 个潜在 T 细胞决定簇表达盒的多价抗原决定簇基因“FHG”置于 CMV 启动子控制下，插入到 TK-/gG-/Pl+基因组的 gE/gI 基因内，构建了新型重组病毒 FHG/P1/PRV，对仔猪免疫表明，FHG/P1/PRV 强 于 或 者 可 与 TK-/gG-/Pl+相 比 ， 增 强 了FMDV 特异性中和抗体和细胞免疫反应，更重要的是前者免疫的猪体内检测。
2.9寄生虫病 / PR V 重组疫苗
    Wei 等分别构建了表达日本血吸虫 26 ku 谷胱甘肽 S- 转移酶(Sj26GST)和脂肪酸结合 蛋 白 (SjFABP) 的 PRV 重 组 疫 苗 株 rPRV/Sj26GST、rPRV/SjFABP 和 rPRV/Sj26GST- SjFABP，3 种重组疫苗免疫的小鼠均产生了特异的抗成虫可溶性抗原(anti-SWAP)抗体和脾细胞增殖反应，及产生 IFN-γ、IL-2，并且三价苗产生特异性免疫反应和保护作用均显著强于二价苗[25]。Nie 等构建了两个重组 PRV 疫苗株 rPRV-SAG1 和rPRV-MIC3，分别表达鼠弓形体 SAG1 和 MIC3 蛋白基因。两种 rPRV 能诱导机体产生显著的体液免疫和 Th1 细胞免疫，在小鼠体内均产生高水平的弓形虫溶解抗原(TLA)特异抗体，引起脾细胞增殖反应和产生 IFN-γ、IL-2，而且在小鼠模型体内，产生抗 PRV 的中和抗体和抗弓形虫 RH株致死性攻击的部分保护作用。两种重组病毒共同免疫小鼠，能够产生更高水平的弓形虫特异 IgG 抗体、淋巴细胞增殖反应，从而提供更有效地抗弓形虫攻击的保护作用[26]。
2.10多个外源基因 / PR V 重组疫苗
    CSFV-PRRSV-PRV三价基因工程疫苗。刘燕等筛选获得了一株插入 CSFVE2、 PRRSV GP5 与 LacZ 基 因 的 重 组 PRV (rPRV-E2-GP5)，重组病毒感染 Vero、PK-15、IBRS2 和 CEF 细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒无显著差异。实验结果表明在 PRV 基因组中可以插入多个外源基因，为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础[27]。PCV2-PPV-PRV 三价基因工程疫苗。将包含 PPV VP2基因和 PCV2 ORF2 基因插入真核表达载体 pPI-2.EGFP中，将重组质粒的 DNA 和 PRV SA2l5 株的 DNA 共转染Vero 细胞，构建重组病毒 PRV SA215(D1)株。重组病毒可以在 Vero、MDBK、ST 和 IBRS-2 等多种细胞中增殖。接种仔猪结果显示，免疫仔猪的 PPV、PCV2 抗体水平均逐渐升高，并分别从接种后第 14 d 和 21 d 开始，PPV、PCV2 抗体转为阳性[28]。SA215(D)毒力显著低于 PRV Fa强毒株，可以抵抗 PRV Fa 强毒株的攻击，并能抵抗其在小鼠体内的定植；可以诱导小鼠产生体液免疫反应和较强的淋巴细胞增殖反应。
    FMDV-PPV-PRV 三 价 基 因 工 程 疫 苗 。 利 用 PRVTK-/gE-/LacZ+缺失株，构建共表达 FMDV 衣壳蛋白前体P1-2A 和 PPV VP2 蛋白的 rPRV。P1-2A 与 VP2 蛋白均得到表达，增殖滴度与亲本株差异不明显；重组病毒对小鼠安全性良好，可以诱导小鼠对 3 种病毒产生明显的免疫反应，初步验证了其具有抵抗 PRV 的保护性。JEV-PPV-PRV 三价活载体疫苗。将密码子优化的 JEV多抗原表位基因 e 和 PPV VP2 嵌合基因 Ve 连接到 PRVSA215 通用转移载体中，构建了 rPRV SA215(G)。外源基因 Ve 几乎不影响亲本株 SA215 的生物学特性，电镜观察到 SA215(G)在 Vero 细胞培养物中形成比 VP2 病毒样颗粒稍大的类似颗粒，推测表达了 Ve 嵌合病毒样颗粒。免疫猪能够诱导较强的 JEV、PPV 和 PRV 体液免疫应答和 Thl型和 Th2 型细胞免疫应答，主要为 Thl 型，能够产生与亲本株类似的中和抗体效价，可以作为预防 JEV、PPV 和PRV 的活载体疫苗的优良候选株。
2.11其他病毒 / PR V 重组疫苗
    除了常见的主要传染病外，PRV 作为活载体得到了广泛应用，如在病毒性腹泻方面：宋岩等获得了表达猪轮状病毒(PRV) vp4 主要抗原位点基因(vp4-MASG)的 rPRV vp4-MASG-PRV。在 Vero 中表达的目的蛋白主要分泌到感染细胞的胞浆中 / 胞膜上，具有免疫反应性；将其肌肉注射免疫小鼠后，诱导产生特异性抗 PRV 的抗体，具有较好的免疫原性[3]。携带传染性胃肠炎病毒(TGEV) S 基因主要抗原位点基因的重组病毒 TGEV/PRV 也已构建。
    犬病方面除了狂犬病外，李业伟等构建了表达犬瘟热病毒H 蛋白的重组 PRV，H 基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，重组病毒与亲本株的生长曲线、病变特征一致[32]。牛病方面，将牛疱疹病毒 I 型 gE 和 gI 基因整合于PRV gE、gI 双缺失株的 gG 位点进行表达，gE、gI 双基因缺失的 PRV 丧失的毒力因 BHV-1 gE 和 gI 基因的整合而恢复。表明 gE-gI 蛋白是不依赖于病毒和宿主的固有毒力因子，这对于发展基因缺失和重组病毒活载体疫苗具有积极的指导意义。

3应用前景
    PRV 具有外源基因容量大、安全性好、免疫期长、宿主范围广、低成本、不易感染人类等优点[1]，在人医方面早期也有利用其作为载体的应用报道，但近年来应用较少。对较大的基因组，构建重组疫苗时，常采用具有同源重组臂的转移载体与基因组 DNA 同源重组来实现，同源臂越长，重组的机率就越高，而转移载体中同源序列的合适长度、有效的选择标记是决定其实用性的关键；目前，应用较多的同源序列为 gE、gG、TK 基因[1]。由于 PRV载体可以同时插入多个外源基因，并且不影响疫苗株的增殖，重组疫苗免疫动物向宿主免疫系统提呈免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近，免疫接种动物后，可以诱导产生体液免疫和细胞免疫、甚至黏膜免疫，可以实现一针多防，因此研制多价 PRV 活载体疫苗具有良好的应用前景。但对 PRV 的启动子结构和调控机制等尚不十分清楚，外源基因表达水平不高，重组病毒的筛选效率较低。因此，需要对 PRV 活载体疫苗进行更加深入的研究。

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