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王海勇 童钦 王炜 武华
中国农业科学院 特产研究所
华威特(北京)生物科技有限公司
牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3，BPIV3)为单股负链 RNA 病毒目、副黏病毒科、副粘病毒亚科、呼吸道病毒属的成员之一。BPIV3 是引起牛和其它反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒。BPIV3 引起的病症为牛副流行性感冒，又称“运输热” ，是一种急性接触性传染病。BPIV3 和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)共同构成了牛呼吸道综合征(Bovine respiratorydisease complex，BRDC)的主要病原。目前，BRDC是引起世界范围内的舍饲牛发病和死亡的主要原因，严重威胁养牛业的健康发展。1959 年 Reisinger等在美国从犊牛肾脏中首次分离到 BPIV3[1]，目前BPIV3 的感染已呈世界性分布。BPIV3 已在我国内蒙古、黑龙江、山东等地存在[2-4]。本研究采用血清中和试验对来自全国 12 个省份的牛血清样品做 BPIV3抗体检测，获得 BPIV3 在我国各地的分布规律，从而为 BPIV3 的预防和控制提供可靠的数据依据。
1材料和方法
1.1临床血清样品、病毒株、细胞及抗血清
从黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、湖南和福建 12 个省份不同牛场采集的牛血液样品 2 489 份； BPIV3 阳性血清、阴性血清和 MDBK 细胞均由华威特(江苏)生物制药有限公司研发部实验室保存；DMEM 和马血清购自 Hy-clone 公司。
1.2样品预处理
每头牛采集约 10 mL 血液，无菌分离血清，于 56 ℃水浴中灭活 1 h 后备用。
1.3血清的稀释
利用 DMEM 将血清样品做 2 倍倍比稀释，从 1∶2 稀释到 1∶4 096，每份血清样品做一个重复。
1.4 BPI V3 的稀释
用 DMEM 将 BPIV3 病毒液进行稀释，取 100 μL 的病毒稀释液加入 100 μL 的稀释 血 清 ， 混 匀 后 病 毒 的 最 终 浓 度 应 为 50TCID50/100 μL～300 TCID50/100 μL 之间，将血清与病毒混合液置于 37 ℃ 5% CO2条件下孵育 1 h。
1.5接种 M D BK 细胞
在细胞接种前 1 d，调整细胞浓度为 1×106个 /mL～5×106个 /mL，每孔 100 μL加入 96 孔细胞培养板培养 18 h～24 h。弃去 96 孔板上清培养液，PBS 清洗后将病毒血清混合物按照100 μL/ 孔加入相对应的细胞培养板中培养。
1.6回归滴定确定稀释后病毒毒价
采用最终稀释好的病毒液等量加入培养液做 1∶1 稀释，37 ℃温育1h，取出病毒稀释液做 10 倍倍比稀释，从 10-1稀释到 10-3。将另一细胞培养板的细胞培养液弃去，用 PBS 洗涤 2 次，做好标记，将稀释的病毒液加入细胞培养板，每个稀释度加入 8 个孔，做两个重复，每孔 100 μL，平行做空白对照，完成后同中和细胞培养板共同于 37 ℃培养，于 2 d～5 d 观察结果。
1.7观察结果和结果处理
观察并记录试验结果，使用 Spearman-Karber 计算血清抗体效价和回归滴度。判定标准为：阳性对照血清不产生 CPE，阴性对照血清抗体效价 <2，阳性对照血清效价应在 2 倍于其确定的平均值范围内；被检样品血清的抗体效价≥2 时判定为阳性。
2结果与讨论
2.1 12省份 BPI V3 血清学调查结果各省份血清
样品检测结果如表 1。其中江西省牛血清 BPIV3 抗体阳性率为 27.8 %，阳性率为最低，其他省份均高于 50 %，2/3 的省份样品阳性率超过 80 %，福建省样品阳性率最高，为 100 %。
国外很多国家对 BPIV3 的流行病学调查显示BPIV3 的感染率很高，牛血清样品中的 BPIV3 抗体水平也很高[5-7]。我国对 BPIV3 的报道比较晚，2001年童泽恩等根据内蒙古地区犊牛和幼牛的临床症状和病理变化判断为 BPIV3 感染[8]，这是国内首次关于 BPIV3 的报道。BPIV3 的传播在很大程度上是由于牛只的长途转运。2012 年，霍志云等对我国吉林、内蒙古和山西 3 个省区的 BPIV3 进行血清学调查，结果显示 3 个省份的 BPIV3 感染非常严重[9]。本次调查的 12 个省份中，除了江西等个别省份外，其他省份的牛血清 BPIV3 阳性率很高，这 表明BPIV3 在我国的流行非常普遍并且严重。江西等省的 BPIV3 抗体阳性率相对较低，究其原因：第一，有些省份养牛业不发达，并且以家用水牛居多，比如江西省；第二，地理环境影响，某些省份与外部的交流较少，也是制约 BPIV3 传播的一个重要因素，比如贵州、江西等省份；第三，如河南和贵州等省经济欠发达，和其他地区的牲畜贸易交流较少也可以明显减少 BPIV3 的传播。霍志云等的 BPIV3血清学调查结果证明在养殖业发达的省份 BPIV3 感染是非常值得关注的。
2.2我国区域性BPIV3 感染程度和分布特点
2489份血清样品的检测显示，1 932 份血清样品呈阳性，阳性率为 77.6 %。对 12 个省份进行区域性的数据处理，5 个区域牛血清样品的抗体阳性率很高，但阳性率差异不显著(表 2)。
从我国分区检测结果分析，东北、西北、中部、东南和西南地区牛血清的 BPIV3 抗体阳性率均很高，这表明我国不同区域的 BPIV3 的感染也很严重。表 2 结果显示，东南和西南地区的 BPIV3 血清阳性率相对较低，南方地区规模化养牛业不发达，牛只的运输和交易相对较少，这限制了 BPIV3 在这一地区的传播。结果还显示，养牛业发达的东北西北和养牛业较发达的中部地区 BPIV3 感染率很高，这与该地区频繁的牲畜贸易和调运有关。另外在靠近沿海的辽宁、山东和福建等省份 BPIV3 的感染率也很高，这也反映了我国沿海地区牲畜交易也是比较频繁的。
鉴于 BPIV3 在我国牛群中感染的严重性，非常有必要加强对 BPIV3 的监控和预防，尤其在牛只等牲畜的转运方面要加强对该病毒的检测，对 BPIV3阳性动物要及时发现、隔离和治疗；对牛群要做好BPIV3 和 BRDC 相关病原的监控，对外来牛只和物品做好预防和消毒工作；牛群养殖密度要合理，做好牛舍卫生和消毒工作，减少 BPIV3 和 BRDC 的发生。