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李倩倩，曾显营，白洁，邓国华，李雁冰，刘丽玲，施建忠
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
兽医生物技术国家重点实验室
农业部动物流感重点开放实验室
禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科的A型流感病毒引起的一种家禽和野禽的疾病综合征。根据病毒表面结构蛋白和抗原性的不同可以将A 型流感病毒分为多种血清亚型，目前已鉴定出有17 种 HA 亚型和 10 种 NA 亚型[1]。其中，H5 亚型AI 病毒(AIV)属于 高 致 病 性 AIV (HPAIV)。我国1996 年首次在南方鹅体内分离到 H5N1 亚型 HPAIV[2]。AIV 极易发生变异，其毒力也不断增强，宿主范围不断扩大，多种家禽、野鸟及哺乳动物均可以感染H5N1 亚型 HPAIV[3]，造成重大经济损失，而且该亚型病毒频繁突破种间障碍，导致人的感染和死亡。鹌鹑在我国的养殖规模较大，鹌鹑对多种亚型AIV 易感[4]，H5N1 亚型 HPAIV 能够引起鹌鹑高发病率和高死亡率。另外，鹌鹑是 AIV 传播人体的中间宿主[5-6]。研究鹌鹑在 AIV 传播过程中的作用具有重要的公共卫生学意义。
由于 HA 基因不断发生遗传变异，目前 H5 亚型 AIV 分为不同的基因分支(Clade 0-9)[7]。不同分支的病毒株对禽类的致病性也存在差异。本研究选择2009 年～2012 年监测到的 Clade 2.3.2 和 Clade 7.2中具有代表性的 4 株 H5N1 亚型 AIV 分离株对鹌鹑进行人工感染试验，研究其对鹌鹑的致病性及接触传播能力，为 HPAI 的有效防控提供实验依据。
1材料和方法
1.1病毒株
4株H5N1 亚型 AIV 分离株：3 株Clade 2.3.2 病 毒 株 A/Great Crested Grebe/Qinghai/1/2009(GCG/QH/1/09，108.5EID50)、A/Duck/Guangdong/S1322/2010 (DK/GD/1322/10， 109.17EID50)、 A/Duck/Guizhou/S4102/2010(DK/GZ/4102/10，108.84EID50)和 1株 Clade 7.2 病 毒株A/Chicken/Ningxia/2/2012 (CK/NX/2/12，108.5EID50)均由本研究所国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存。
1.2鸡胚和实验动物
10日龄 SPF 鸡胚由本研究所实验动物中心提供；10 日龄非免疫鸡胚由哈尔滨维科生物技术开发公司提供；4 周龄鹌鹑购自哈尔滨市某鹌鹑养殖场，经检测其体内 H5、H7、H9 亚型 AIV 和新城疫病毒血凝抑制(HI)抗体均为阴性。
1.3人工感染试验
将 60 只 4 周龄鹌鹑随机分成4组，每组 15 只，4 组分别感染病毒株 DK/GD/1322/10、DK/GZ/4102/10、GCG/QH/1/09、CK/NX/2/12。4 株病毒株分别以灭菌 PBS 稀释到终浓度为105EID50，以 100 μL/ 只的剂量鼻腔感染鹌鹑，每组于感染后 24 h 放入 7 只未感染鹌鹑作为同居对照。连续 14 d 每天观察并记录感染组和同居组鹌鹑的发病和死亡情况。感染试验在生物安全防护三级(P3)实验室的负压隔离器中进行。
1.4样品采集
对感染组鹌鹑和同居组鹌鹑分别于感染和同居后 2 d、4 d、6 d 和 8 d 分别采集喉头和泄殖腔拭子，用于拭子病毒滴定。分别于感染和同居后 48 h 每组随机迫杀 3 只感染组鹌鹑和 2 只同居组鹌鹑，无菌采集脑、气管、心、肝、脾、肺、肾、盲肠和胰脏 9 个脏器样品各两份，分别用于脏器病毒滴定和病理组织学分析。
1.5病毒滴定
将喉头和泄殖腔拭子经含有双抗的 PBS 稀释，将各脏器样品称重后按 1∶10 (m/v)的比例加入含有双抗的 PBS，捣碎后离心，上清液经含双抗的 PBS 稀释，均以 100～10-7稀释度尿囊腔途径接种 3 枚 10 日龄非免疫鸡胚，37 ℃孵育 48 h，通过血凝试验测定血凝活性，利用 Reed-Muench 法计算病毒株的 EID50，检测排毒情况及病毒在鹌鹑体内的复制情况。
1.6抗体转阳检测
对感染组鹌鹑和同居组鹌鹑分别于感染和同居后 7 d 和 14 d 采血，分离血清，通过 HI 试验测定抗体效价，以此检测鹌鹑体内抗体转阳情况。
1.7病理分析
对鹌鹑各脏器采用常规方法制备组织切片，观察并分析各脏器病理组织学变化。
2结果
2.1临床观察结果
感染组中，DK/GD/1322/10、DK/GZ/4102/10 和 GCG/QH/1/09 组均于感染后第 2 d大量鹌鹑开始发病，精神极度沉郁、走路打颤，其中 DK/GD/1322/10 和 DK/GZ/4102/10 组 2 d 内全部死亡，而 GCG/QH/1/09 组于第 3 d 全部死亡；CK/NX/2/12 组鹌鹑发病和死亡较慢一些，第 3 d 开始发病，5d 内全部死亡。4 株病毒对鹌鹑的平均致死时间依次为 48 h、48 h、67 h 和 98 h。同居组中，DK/GD/1322/10、DK/GZ/4102/10 和 GCG/QH/1/09 组均于同居后第 2 d 开始发病，而全部死亡时间有所差异，分别于同居后 6 d、4 d 和 3 d 内 全部死亡；而CK/NX/2/12 组同居鹌鹑全部存活，并未发病(图 1)。
2.2拭子病毒滴定
4株病毒的感染组鹌鹑和DK/GZ/4102/10、GCG/QH/1/09 2 株病毒的同居组鹌鹑的喉头和泄殖腔均于第 2 d 开始 100 %排毒；DK/GD/1322/10 同居组于第 2 d 仅 2/7 的鹌鹑排毒，第 4 d 存活鹌鹑开始全部排毒；CK/NX/2/12 同居组鹌鹑均未排毒。各排毒组不同时间的喉头的排毒量均比泄殖腔高。CK/NX/2/12 感染组鹌鹑与其他 3 株病毒感染组鹌鹑相比排毒量较低。DK/GD/1322/10DK/GZ/4102/10 和 GCG/QH/1/09 3 株病毒株的感染组鹌鹑均比相应同居组鹌鹑排毒量高(表 1)。
2.3病毒体内复制
3株 Clade 2.3.2 病毒在感染组和同居组鹌鹑各脏器均有复制；不同病毒在鹌鹑体内的复制能力不尽相同，其中 GCG/QH/1/09 感染组鹌鹑体内各脏器病毒含量最高，滴度在 5.13～6.88log10 EID50/0.1 mL 之间；同一病毒在鹌鹑体内不同脏器中的复制能力也有所差异，3 株病毒株均在肺中的含量最高，脾和脑次之。Clade 7.2 病毒在感染组鹌鹑各脏器也均有复制，但复制能力较弱，其在脑中的含量最高，达到 4.42 log10 EID50/0.1 mL，而在肝、脾和盲肠中的含量较低；该病毒在同居组鹌鹑各脏器无复制(图 2)。
2.4抗体转阳检测
4株病毒直接感染组鹌鹑和3株 Clade 2.3.2 病毒同居感染组鹌鹑在感染后 6 d 内全部发病死亡，无法进行血清抗体转阳测定；Clade7.2 病毒株 CK/NX/2/12 同居组中 2/5 鹌鹑于同居后7 d、14 d 出现血清转阳，抗体效价均为 4 log
2.5病理组织学观察
除 CK/NX/2/12 同居组鹌鹑各脏器未发生病变外，4 株病毒直接感染组鹌鹑和3 株 Clade 2.3.2 病毒同居感染组鹌鹑的各脏器均出现明显的病理组织学变化：大脑的小胶质细胞增生，毛细血管出现血管套；气管的黏膜固有层毛细血管淤血，散在出血，黏膜上皮少量脱落；心肌局部出血，伴有较多炎性细胞灶状浸润；肝脏出现淤血，血栓，肝细胞空泡变性；脾脏的白髓淋巴细胞大量减少；肺脏中三级支气管内纤维素渗出，支气管平滑肌少量脱落；肾小球萎缩，部分肾小管上皮细胞核固缩；盲肠固有层增生，黏膜上皮细胞及部分固有层均脱落；胰脏的腺泡细胞局部坏死，坏死灶周围有部分腺泡细胞空泡变性，坏死灶中央少量出血。
3讨论
鹌鹑是 AIV 的宿主之一，我国鹌鹑养殖量较大，H5N1 亚型 AIV 对鹌鹑致病性的研究对鹌鹑的AI 防控具有重要意义。本研究选择不同分支不同来源的 4 株 H5N1 亚型 AIV，对鹌鹑致病性研究结果显示，2 种分支病毒对鹌鹑均呈高致病性，但 3 株Clade 2.3.2 病毒致死性更高，表现为感染鹌鹑死亡更快，排毒量更高，同时 3 株 Clade 2.3.2 病毒在鹌鹑各脏器中均呈高拷贝复制，在肺中的含量最高，脾和脑次之，这与 Makarova 等报道的呼吸道是其主要复制部位相一致。
病毒在禽群间的传播能力直接关系到病毒对禽类的危害。H5 亚型 AIV 与 H1N1 亚型流感病毒重组后获得空气传播能力[8]。病毒在鹌鹑间的传播能力越高则表明该类病毒对鹌鹑的危害越大。传播能力试验中，4 株病毒在鹌鹑群体中的接触传播能力存在一定差异。3 株 Clade 2.3.2 病毒对鹌鹑具有完全接触传播能力，而 Clade 7.2 病毒对鹌鹑接触传播能力很弱，接触鹌鹑未发病死亡，仅部分接触鹌鹑抗体转阳。这可能是与 Clade 7.2 病毒直接感染组鹌鹑排毒量较低，不足以使同居鹌鹑发病并排毒。
AIV 对鹌鹑的不同致病性及接触传播能力可能受多种因素的影响。本研究显示，不同分支的不同H5N1 亚型 AIV 可能是导致其致病性不同的原因之一，但不同 AIV 对鹌鹑的致病相关分子机制仍有待进一步研究。
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