阿莫西林在鸡血浆中的残留消除规律

倪海球 孙礼瑞 谢恺舟 郭辉生 谢星 赵敏 史良峰 王建平 张跟喜 戴国俊 王金玉
扬州大学动物科学与技术学院
江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室
南京农业大学动物医学院

    阿莫西林 （Amoxicillin， AMO） 是一种带有氨基侧链的半合成青霉素， 对革兰氏阳性菌有很好的杀菌作用， 在耐酸碱及抗菌谱方面比青霉素抗菌效果更好。若大量、 不合理的使用阿莫西林会造成严重的药物残留问题， 如今动物源性食品中阿莫西林残留是欧盟和日本等国家的必检项目之一。我国农业部第 235 号公告规定阿莫西林在畜禽可食性组织中最高残留限量 （MRLs） 为50 μg/kg。目前， 国内外对AMO的残留检测方法虽有研究［4~7］， 但到目前为止， 关于鸡血浆和组织中AMO残留消除规律尚未见报道。本研究在国内饲养条件下， 试验鸡分别以25.0、 50.0 mg/kg剂量内服AMO， 每天给药1次， 连续5 d， 测定给药前后不同时间鸡血浆中AMO残留量的变化， 研究阿莫西林在鸡血浆中的残留消除规律 （鸡组织中的残留消除规律另外报道） ， 为养鸡业科学合理使用阿莫西林提供依据。

1材料与方法
1.1试验动物及分组
选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡 （来自江苏京海禽业集团有限公司京海黄鸡资源场） 90只， 体重（1.75±0.20）kg， 随机分成3组， 分别为阿莫西林试验组 （A、 B组） 、 空白对照组 （C） ， 试验组给药剂量分别为每天25、 50 mg/kg， 产蛋鸡均单笼饲养， 给药前分别称重、 编号。试验前预饲1周， 饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料 （自制于江苏京海禽业集团有限公司饲料厂） ， 自由饮水。
1.2标准品、 药品及主要试剂
阿莫西林标准品： 纯度98.00%， 德国Dr. Eh⁃renstorfer 公司， 批号 70920； 阿莫西林原粉： 纯度97.75% （实测含量） ， 江苏倍康药业有限公司； 乙腈： 色谱纯， 美国Tedia有限公司； 磷酸二氢钾、 磷酸二氢钠： 分析纯， 国药集团化学试剂有限公司； 二氯甲烷、 三氯乙酸： 分析纯， 国药集团化学试剂有限公司； 水杨醛： 分析纯， Aladdin Chemistry公司。
1.3主要仪器
高效液相色谱仪 （配备 2 台 515型高压泵、2475 型荧光检测器， 美国 Waters 公司） ； pH 计（ DELTA320型， 瑞士Mettler Toledo公司） ； 恒温磁力搅拌器 （85-2型， 上海斯乐仪器厂） ； 高速冷冻离心机 （5804R型， 德国Eppendof公司） ； 电子分析天平（Ax205型， 瑞士Mettler Toledo公司） ； 数显恒温水浴锅 （HH-8型， 江苏金坛市中大仪器厂） ； 漩涡混合器 （G560E型， 美国Scientific Industries有限公司） 。
1.4给药途径及样品采集
将阿莫西林原粉用无菌超纯水配成50.0 mg/mL的水溶液， 然后将药液直接注入到鸡嗉囊中。试验组鸡每天给药1次， 给药时间均在8 ∶ 00~9 ∶ 00，连续 5 d， 自给药日起至停药后 10 d 内， 于每天10 ∶00~11 ∶00 采集各试验组鸡血浆， 样品保存在-70 ℃冰箱中。
1.5试验方法
1.5.1色谱操作条件及参数
色谱柱： Athena C18； 保护柱： C18柱； 检测器： 荧光检测器， 激发波长354 nm， 发射波长445 nm； 流动相： 0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液 （用0.1 mol/L的磷酸氢二钾溶液调pH值至5.5） （A） 和乙腈溶液 （B） ， 在0~8 min内溶剂A体积为65%， 8~9 min内溶剂A体积含量从65%减少到40%， 平衡5 min， 14~15 min溶剂A增加到65%， 再平衡4 min； 进样体积： 100 μL；柱温： 40 ℃。
1.5.2标准品衍生化反应条件的优化
在Luo等报道的最优衍生条件的基础上， 对阿莫西林衍生化反应条件进行优化， 其衍生条件包括三氯乙酸的添加质量浓度、 水杨醛的添加量、水浴温度、 衍生化反应时间。
1.5.3样品提取与净化
于200 μL鸡血浆样品中先加入 500 μL 乙腈溶液， 漩涡振荡混匀 2 min， 10 000 g离心5 min。取上清液， 向其加入800 μL饱和的二氯甲烷溶液漩涡混匀2 min， 10 000 g离心10 min。取100 μL上层水相至10 mL具塞的玻璃离心管中， 准备衍生反应。
1.5.4样品衍生化
向上述10 mL离心管中分别加入200 μL 15%三氯乙酸溶液、 20 μL水杨醛， 漩涡振荡混匀1min，将其放入沸水浴中， 衍生反应持续45min。反应后取出样品， 冷却至室温， 将样品转移到2 mL离心管中， 分别用50%乙腈溶液洗涤10mL玻璃离心管2次，合并到2 mL离心管中， 最后用500 μL 50%乙腈溶液定容至2 mL。上机前20 000 g离心15 min， 过0.22 μm滤膜， 滤液供高效液相色谱 （HPLC） 检测。
1.5.5标准曲线、 检测限及定量限
用血浆基质液分别将阿莫西林储备液稀释成质量浓度为5.0、 25.0、 50.0、 250.0、 1 250.0、 2 500.0、5 000.0 ng/mL 的基质标准工作液， 进行 HPLC 分析。每个浓度点重复测定3次， 取平均值绘制浓度（C） -色谱峰面积 （A） 标准曲线。按1.5.3和1.5.4的方法制备空白血浆， 向其添加一定浓度的阿莫西林标准溶液， 进行HPLC分析， 逐渐降低阿莫西林的浓度， 以样品检测时的信噪比 （S/N） 为 3和10分别作为检测限和定量限。
1.5.6样品回收率测定
吸取200 μL空白血浆， 分别置于2 mL离心管中， 同时添加低、 中、 高3种浓度的标准工作液， 每个添加量设6个平行， 经1.5.3和1.5.4的方法提取和净化后， 100 μL进样作HPLC检测， 以外标定量法计算添加回收率。
1.5.7样品精密度的测定
将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份， 得到低、 中、 高3种药物浓度的样品。在同日内不同时间用同一台HPLC 6次重复测定低、 中、 高3种药物浓度的样品， 求得日内 （批内） 精密度。在一周内不同日用同一台HPLC 6次重复测定低、 中、 高3种药物浓度的样品， 求得日间（批间） 精密度。
1.5.8鸡血浆中阿莫西林的测定
按外标法， 将鸡血浆中所测阿莫西林的色谱峰面积分别代入基质标准曲线， 得到鸡血浆中阿莫西林的残留量。

2结果与分析
2.1衍生条件优化
分别优化了水杨醛与阿莫西林的反应条件， 得到其衍生化反应最佳条件为： 15%三氯乙酸200 μL，水杨醛20 μL， 100 ℃水浴中加热45 min。
2.2色谱分离
在选定的色谱条件下， 测得血浆中AMO保留时间约为8.15 min， 色谱峰峰形较佳， 空白血浆在上述保留时间无干扰峰出现。
2.3标准曲线
分别以阿莫西林的色谱峰面积 （A） 对进样药物的质量浓度 （C， μg/mL） 作图， 得到其标准曲线。阿莫西林的线性回归方程为 C=3.1946A+0.4158， 线性相关系数r=0.9999。
2.4样品回收率及精密度
鸡血浆中AMO的添加回收率及变异系数见表1。由表1可知， 在空白样品中， 当阿莫西林添加水平分别为5.0、 25.0、 125.0 μg/mL时， 该方法鸡血浆样品平均回收率在74.72%~83.50%， 相对标准偏 差 在 5.77%~8.65% ； 日 内 相 对 标 准 偏 差 在2.99%~4.99%； 日间相对标准偏差在7.30%~7.98%。结果表明， 该检测方法可靠， 重复性好。
2.5灵敏度
应用本试验建立的检测方法， 测得鸡血浆中阿莫西林的检测限为2.0 ng/mL （S/N=3） 、 定量限为5.0 ng/mL （S/N=10） 。结果表明， 该方法灵敏度高，完全能满足阿莫西林在鸡血浆中残留检测需要。
2.6鸡血浆中阿莫西林残留量的测定
鸡血浆中AMO残留量的测定结果见表2。由表2可以看出， 各试验组产蛋鸡每天分别给予阿莫西林 （AMO） 25.0、 50.0 mg/kg， 每天1次， 连续5 d内服给药后， 血浆中AMO残留量均呈上升趋势， 在给药第5天时， 其浓度达到峰值。休药第1天时， 血浆中AMO浓度急剧下降； 休药第2天时， AMO在血浆中的浓度低于检测限。

3讨论
3.1衍生化条件的优化及样品的提取与净化
    通过试验比较， 水杨醛与目标物的衍生产物灵敏度高于甲醛与目标物的衍生产物灵敏度， 故本试验选用水杨醛作为衍生化试剂， 与Luo等所报道结果一致。参照Luo等最佳衍生化条件， 本试验筛选出的最佳衍生化条件为： 15%三氯乙酸200 μL、 水杨醛20 μL、 100 ℃水浴中加热45 min。由于生物样品提取液中含有大量的蛋白质等干扰组分， 这些干扰组分既使阿莫西林回收率降低， 也可与阿莫西林形成共价键， 阻碍衍生反应的进行， 所以去蛋白步骤非常关键。去蛋白常用的有机溶剂有乙腈、 丙酮、 乙醇、 甲醇、 三氯醋酸、 高氯酸等， 而pH较低的溶剂会对阿莫西林产生不同程度地降解。甲醇的去蛋白效果与乙腈相比不是很理想。利用阿莫西林易溶于水而不溶于二氯甲烷， 通过二氯甲烷除去萃取液中的乙腈溶液， 使阿莫西林被萃取到上层水溶液中， 同时二氯甲烷可对阿莫西林做进一步提取和净化。因此本试验建立的采用乙腈作为去蛋白溶剂和药物提取剂、 二氯甲烷为萃取剂的样品前处理方法， 不仅可有效地提取鸡血浆中阿莫西林残留， 而且带进的内源性物质少， 简化了样品前处理步骤， 提取与净化效果好， 鸡血浆中阿莫西林平均回收率均在74.72%~83.50%之间， 符合AOAC残留检测要求。
3.2阿莫西林在鸡血浆中的残留消除规律
    本试验结果表明阿莫西林在投药前后鸡血浆中的消除趋势基本一致。在投药期间， 投药第1天，血浆中即可检测到AMO的残留浓度， AMO在鸡体内吸收较快； 在投药第5天， 鸡血浆中AMO达到峰值； 休药第1天， 其残留浓度急剧下降， 这与AMO在血浆中的半衰期较短有关； 在停药第2天， 血浆中AMO低于检测限。表明AMO在鸡血浆中吸收迅速， 消除也迅速。

4小结
    黄羽肉鸡分别以 25.0、 50.0 mg/kg 剂量内服AMO， 每天给药1次， 连续5 d内服给药后， 在给药期间， 鸡血浆中AMO残留量呈上升趋势， 给药第 5 天时， 血浆中药物浓度达到峰值。在停药第1天时， 血浆中AMO药物浓度急剧下降； 在停药第2天时， 血浆中药物浓度低于检测限 （2.0 ng/mL） ；阿莫西林在鸡血浆中的残留量与 转座子Tn1548遗传标记［6］， tnp513是2008年新证明的编码转座酶序列的转座子［9］。intⅠ、 intⅡ和intⅢ则是3类整合酶的标志。
    本试验结果显示， 57株鸡源多重耐药共检出traA、 trbC、 ISEcp1、 IS26、 tnpA、 tnp513、 intⅠ和intⅡ8种可移动遗传元件， 每株多重耐药大肠杆菌均可检出可移动遗传元件， 最少可检出1种可移动遗传元件， 最多可同时检出7种可移动遗传元件， 而且本次检测的鸡源大肠杆菌耐药种类越多， 可移动遗传元件的检出也越多。以上结果可见本试验多重耐药大肠杆菌都携带了接合性质粒、 转座子或整合子等可移动遗传元件， 而且本试验多重耐药大肠杆菌对β-内酰胺类、 氨基糖苷类、 喹诺酮类、磺胺类等抗菌药物的多重耐药可能与它们携带接合性质粒、 转座子和整合子等可移动遗传元件相关。本试验所用菌株来源于不同地区和不同的物种， 接合性质粒、 转座子及整合子的检出率较以往的报道不一致， 但无论何种来源的多重耐药大肠杆菌， 可移动遗传元件的检出率都较高， 进一步提示了多重耐药与可移动遗传元件的关系。
    本试验还发现即使携带相同的可移动元件， 大肠杆菌的多重耐药程度也可能不同， 这可能因为同种可移动元件所携带的耐药基因不同。另外， 质粒、 转座子和整合子等可移动遗传元件除了携带耐药基因， 在耐药基因的水平移动中也起重要作用，这些可移动遗传元件携带着耐药基因发生转移， 就可能在同种细菌菌株间， 或不同种、 属细菌菌株间广泛传播， 形成对某种抗生素的耐药性。关于不同可移动元件所携带的耐药基因， 其介导的某种药物耐药以及可移动遗传元件如何携带耐药基因发生水平转移等问题还有待进一步研究。

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