如何做好禽流感实验室诊断监测方法应用分析

纪家玉 杨凌 卞红春 朱明
江苏省盐城市疫病预防控制中心

    禽流感（Avian influenza,AI）是由A 型流感引起的禽类疫病。 可感染包括鸡、火鸡、鹅等家禽以及野鸟、海鸟等。因为其引起的疾病形式多样，可分为无致病性、 低致病性和高致病性（HPAI）的。 HPAI 一旦爆发，将对当地的养禽业造成毁灭性的打击， 农业部将此病列为一类动物传染病。禽流感病毒有众多亚型， 其中按血凝素（HA）分有 15 种，神经氨酸酶（NA）有 9 种，各亚型之间抗原抗体存在交叉反应， 要做好该项疫病的诊断和监测存在一定的难度。 目前已经建立了抗原如血凝/血凝抵制、 免疫荧光、 捕获 ELISA、 免疫胶体金、RT-PCR，抗体如琼脂扩散、间接 ELISA 等法。

1高致病性禽流感实验室诊断监测方法的选择
1.1选择原则
1.1.1检测方法的各项性能，包括有效性、准确性、精确性、灵敏度、特异性。在这些性能中最重要的是有效性、灵敏度和特异性。 有效性是指检测的方法能否说明需要回答的问题。 灵敏度是反映阳性样品被检测为阳性的概率。 特异性是指阴性样品被检测为阴性的概率。对于同一批样品，检测的灵敏度越低则假阴性出现的概率越高，特异性越低则假阳性出现的概率越高。
1.1.2检测方法的操作难度。
1.1.3检测方法操作的危险程度，因为有些检测需要采用一些有毒有害的试剂和生物材料。
1.1.4检测需要的时间。
1.1.5检测所需要的经费。
1.2高致病性禽流感实验室诊断监测方法
1.2.1常规血清学试验： 琼脂扩散（AGID） 试 验 、 血 凝 抑 制 （HI） 试 验 、ELISA。
1.2.2快速病原学检查： 免疫胶体金。
1.2.3实验室确诊：RT-PCR、 荧光
RT-PCR、NASBA。
1.3各种方法的比较
1.3.1琼脂扩散（AGID）试验：(1）依据标准 GB/T18936。(2）原理及用途：将样品采集后接种到鸡胚， 检测鸡胚尿囊液若有血凝活性， 即可将其绒毛尿囊膜制成抗原， 再用禽流感病毒标准阳性血清进行琼脂扩散试验， 以此来检测禽流感病毒的存在。 该方法用于病毒鉴定， 同理可以用标准抗原检测血清中的病毒抗体。 (3）适用性及局限性：方法操作简单，所需时间短。 但敏感性低；不能鉴别亚型；同时对于已免疫的群体， 不能区别是感染还是免疫引起的；特异性低，对发病迅速、死亡率高的 HPAI，往往检测不到抗体。
1.3.2 HA/HI 试验：(1）依据标准 GB/T18936。 (2）原理及用途：禽流感病毒具有凝集红细胞的特性， 这种特性能被特异性抗血清抑制。 因而可以用已知病毒来检查血清中的相应抗体，也可用已知血清来鉴定求知病毒。 可以用禽流感病毒 15 种血凝素亚型血清对样品进行分型鉴定， 也可以检测血清中各亚型血凝素抗体。 (3）适用性及局限性： 操作简单快速， 试剂容易获得，可以鉴定血凝素亚型，直接反映抗体水平。但不能区分感染与免疫，发病迅速、 死亡率高的 HAPI 往往检测不到抗体，而且存在明显的交叉反应。
1.3.3 ELISA 试验：(1）依据标准 NY/T770-2004。 (2） 原理及用途： 间接ELISA。 用于检测所有 A 型流感病毒的抗体，也可以用于诊断和监测。 (3）适用性及局限性： 该方法较前两种方法具有更好的敏感性和特异性， 适合批量测定。
1.3.4 免疫胶体金试纸条：(1）原理及用途： 胶体金是用 HAuCL4 经过超声波处理或加热搅拌制备而成的， 在电解质中用已知抗禽流感病毒抗体将其包被成免疫胶体金试纸， 当有特异性禽流感病毒存在时， 与其结合形成肉眼可见的沉淀线。 该方法主要用于现场快速诊断，检测病原。 (2）适用性及局限性：快速简单，用于现场初筛。 但灵敏性低， 检测出约为 RT-PCR 的60%。 特异性也较低，阳性样品需进一步确诊。
1.3.5 RT-PCR：(1） 试 验 依 据 标 准NY/SY-533-2009。 (2）原理及用途：利用离心柱内硅基质膜提取 RNA，在反转录酶的作用下， 以 RNA 为模板，以引物为起点合成与 RNA 模板互补的CDNA 链。 在 TaqDNA 聚全酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异 DNA 片段的拷贝数放大一倍。 经过 35 次循环，最终使扩增DNA 片段放大了数百万倍。 将扩增DNA 片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到 DNA 片段的扩增带。 该方法用于检测禽血清、组织、分泌物和排泄物中 AIV。 (3）适用性及局限性：与病毒分离相比，该方法耗时短、敏感性高于 ELISA、胶体金试纸条。 但不利于大批量样本的监测。
1.3.6 荧光 RT-PCR：(1）试验依据标准 GB/T19438.1-2004。 (2) 原理及用途：荧光标记扩增产物，动态监测荧光信号变化。 R-报告荧光基团，Q-淬灭荧光基团。 实时定量 PCR 技术是 PCR技术和荧光检测技术的结合， 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控 PCR 反应过程，通过仪器和相应软件分析结果， 对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。 (3)适用性及局限性：检测速度快，敏感性高于 RT-PCR，但成本较高，仪器昂贵。1.3.7NASBA：(1) 试验依据标准 GB/T19440-2004。 (2)原理及用途：等温条件下序列特异性核酸扩增，从 RNA 开始扩增，特别适合 RNA 病毒。 (3)适用性及局限性：操作简单，特异性强，反应快速，忠实性好，不需要电泳，容易检测，但实验室条件要求较高。

2 检测结果的分析、判断与报告
2.1 检测结果的分析与判断
在选择了正常的检测方法进行实验得出结果后， 要对结果进行客观的分析与判断，主要考虑：
一是检测方法的本身评价如何；
二是检测过程中是否有质量控制，是否设置了阴、阳性，检测人员的操作规范与技术水平等；
三是病原的存在、 抗体的消长与疫病或感染之间的关系如何; 四是检测结果是否符合流行病学特征; 五是样品的采集、运输和保存情况;六是设施设备状况及检测试剂的质量。
2.2监测结果的报告
根据监测的目的， 回答监测方案所设立的问题。

主要包括：

一是疫病在时间、 地理、 宿主群体中有何分布特征，主要是三间分布及四维分布;

二是是否有新的疫病发生;

三是疫病存在的情况、疫情发展的趁势;

四是有关控制措施是否有效， 如免疫的措施是否到位;

五是病原是否发生型别、毒力、耐药性方面的变异。

3检测、监测的预警、预告动物疫情的预警、 预告是对动物疫病未来一段时间内发生概率和发展趋势及其可能造成的影响的一个预测，以及控制这种疫病的紧迫性、必要性和效益分析。
   禽流感疫情预警预测预报工作可以用采取以整个地区所有监管养殖场、100 只以上禽类养殖户的跟踪免疫监测结果和定期家禽交易市场、流通等环节的动物免疫抗体抽测结果为基础，依据时间、地理层面特征和发展趋势，同时考虑流行病学特征、饲养模式和防疫措施进行综合分析。 同时了解国内外、周边省市、区县疫情动态，通过这样的分析， 对每个养殖场和各防控环节可能存在的疫情风险点提出疫情预警预报， 有针对性地采取免疫等综合防控措施，提升免疫效果，杜绝重大疫情的发生。

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