广东省部分猪场细环病毒感染状况

王东东 邓雨修 李春梅 卢围 廖承球 潘永飞 周庆丰 宋延华
广东温氏食品集团股份有限公司

    （细环病毒， TTV） 在1997年日本的一例输血性肝炎病人身上首次发现[1]。 TTV归属于圆环病毒科， 指环病毒属。 基因组为单链负链的环状DNA， 约3.8kb左右， 分为编码区和非编码区 （UTR） 两部分。TTV编码区由6个开放阅读框 （ORF1~ORF6） 组成，TTVs具有相同的基因组结构， 但核酸序列差别较大。 有学者根据UTR将TTV分为5个基因型群 （ge-netic group）。 目前已知感染的动物包括灵长类、猪、 禽、 绵羊、 牛、 狗和猫等[3-4]。 猪的TTV主要包括两大基因群TTV1和TTV2。 据国外学者研究结果显示， 不同地区的感染率为24%~100%。 目前普遍认为TTV是非致病的， 但有学者研究结果显示[6]TTV2与PCV2流行有一定相关， 并可能与断奶仔猪多系统衰竭综合征 （PMWS） 之间存在一定的联系。
　　基于UTR区基因序列的PCR方法是诊断TTV感染的主要手段[3-7]， 本研究中我们运用两对PCR引物， 分别对TTV1和TTV2进行了检测， 并对其感染情况进行了调查， 现将结果报告如下。

1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　血清
　　445份血清来自广东省17个规模猪场的正常猪群以及表现发烧、 消瘦、 体况较差的猪只和5个散养户正常猪群送检血清。
1.1.2　试剂
　　DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；
1.2.2　核酸提取
　　参照天根公司DNA抽提试剂盒说明书进行。
1.2.3　TTV1与TTV2的PCR扩增与鉴定
　　以血清提取的DNA作为模板， 用相应引物按下述体系配制： Premix-Taq12.5 μL， 20 pmol/L上、 下游引物各0.5μL， 模板2 μL， 灭菌双蒸水补足25μL。 扩增条件：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s， 55 ℃复性30 s， 72 ℃ 延伸30 s， 共30个循环； 然后72 ℃延伸10 min。 扩增产物经10 g/L普通琼脂糖凝胶电泳鉴定， 将目的片段克隆至pMD18-T载体。 经鉴定后， 将阳性克隆送Takara公司测序。
1.2.4　系统进化树绘制
　　用Clustal X对序列进行比对， 并用MEGA4软件构建系统进化树。 DNA Star软件进行序列同源性比较。

2　结果
2.1　PCR扩增电泳鉴定
　　用血清提取的DNA为模板， 进行PCR扩增， 得到了预期大小的目的片段（图1、 图2） 。
2.2　检测结果统计
　　对445份血清样品进行PCR检测，结果表明TTV总的阳性率为68.1%（303/445） ， 见表2。
2.3　同源性比较结果
　 　 经 过 D N A S t a r 比 对 发现 ，本 研 究 中 所 测 T T V 1 和TTV2之间的同源性分别为91.5%~96.1%和92.8%~98.4%， 与参考毒株相比同源性分别为88.0%~96.7%和81.2%~100% （图3、 图4） 。
2.4　系统进化树分析结果
　　本研究扩增序列经测序后和参考序列用Clustal X进行比对并绘制系统进化树， 结果显示， 所测序列分属两个基因群： TTV1和TTV2， 与预期结果相符，其中Shalan A与Shalan B以及YunheA和Yunhe B为同一份样品中同时检出TTV1和TTV2。

3　讨论
　　TTV在猪群中已经普遍存在， Kekarainen T等[4]的研究显示TTV在猪群中的阳性率为72%。 我们对广东省17个规模猪场和5户散养户猪群的检测结果显示TTV的阳性率为68.1%， TTV1和TTV2阳性率分别为43.1%和24.9%， 证实TTV在广东存在较高的感染率， 并且TTV1阳性率要高于TTV2。 这与Kekarainen T 等[7]和Sibila M 等[8]的研究结果一致， 但与Segalés J 等[9]和王礞礞等[10]的研究结果不尽相同， 可能是由所调查猪群的数量、 方法以及猪群本身的差异所致。
    在我们对散养户检测的64份样品中， TTV1和TTV2各检出了三份阳性样品 （均为4.7%） ， 远低于猪场的TTV阳性检出率 （49.6%和28.3%） 。 所检散养户饲养的猪品种多为土猪， 而猪场的猪品种为经培育后的三元杂猪。 两者TTV感染率相差极大， 是TTV的感染与猪的品种有关， 还是三元杂猪的免疫力不及土猪所致， 或是养殖密度高使得病毒更易传播， 需要进一步收集资料进行研究，
    目前TTV感染在猪群引起何种疾病仍未有报道。 有学者的研究结果表明， TTV和猪的PMWS之间存在一定相关。 Ellis JA等[11]单独接种TTV1、 PCV2或者先接种PCV2再接种TTV1不引起猪的临床症状，但是先接种TTV1再接种PCV2， 12头猪有6头出现急性的PMWS。 Kekarainen T 等[6]发现在PMWS猪群中TTV2的阳性率 （91%） 要高于非PMWS猪群 （72%） 。
    另外， Krakowka S 等[12]检测了22个商业化的猪肺炎支原体疫苗， 结果发现有13个检测到TTV1和TTV2的DNA。 我们也对手头的3个国产的蓝耳病疫苗进行了检测， 并没有检到TTV的DNA存在。 虽然检到病毒的基因组病毒并不代表其仍然具有感染性， 但是仍然具有潜在的风险， 有文献表明TTV同属的PCV2在接种全基因组到猪后可以检到病毒血症。因此， 疫苗中存在的TTV核酸具有潜在的感染危险，今后对疫苗亦应加强检测。
    随着我国养猪业的发展， 养殖规模的不断扩大，疾病成为困扰养猪业发展的一大问题。 TTV作为一种潜在致病病毒， 较高的阳性率应该引起我们的重视。 TTV的致病性以及与其他疾病之间的关系， 需要我们进行深入的研究。

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