猪瘟胶体金快速诊断法的研究进展

罗丹丹 谢晶 李兴玉 廖党金
四川省畜牧科学研究院

    现有检测猪瘟病毒的方法主要包括病毒分离、 抗原捕捉 ELISA、 聚合酶链式反应等， 这些方法需要几小时到几天才能完成，且有的需要熟练的操作者和特殊的仪器。胶体金技术是 20 世纪 80 年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术， 具有操作简单、方便快速、 特异性强、 灵敏度高等优点。其原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细层析作用， 使抗原抗体在固相膜上反应， 由胶体金标记的抗体显色， 阳性反应在膜上呈现红色， 阴性反应则不显色。国内近年来也在医学上研究成功了许多诊断试剂盒或试纸条， 而动物医学方面研究出的产品相对较少， 应用于临床的则更少。鉴于此， 本文就胶体金免疫技术目前在猪瘟诊断中的应用进展作一简要综述， 以期为猪瘟胶体金试纸条的研制提供理论依据。

1利用胶体金技术检测猪瘟抗原
   陈龙斌等 （2007 ） 用 15nm 的胶体金颗粒标记兔抗猪瘟病毒的多克隆抗体， 研制的试纸条可以检测猪瘟病料中的猪瘟病毒。该法与直接猪瘟荧光抗体试验和 RT-PCR 试验的阳性检出率分别为 36.4%、45.5%和 72.7%， 虽然阳性检出率较后两者低， 但该法操作简单、 耗时短， 可用于猪瘟的流行病学调查。张长弓等 （2007 ） 应用胶体金标记猪瘟病毒单克隆抗体（Ab2 ） 制成检测 CSF 抗原的 “猪瘟抗原胶体金快速检测试纸” 。该试纸条可以检测猪瘟病毒和猪瘟弱毒活疫苗， 而对猪源性的其他病毒、 细菌抗原均呈阴性，且具有微量、 特异、 快速和简便等优点， 可以作为检测猪瘟抗原的一种新试剂。姜成等 （2009 ） 、 付连军等（2011 ） 通过采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择 15nm 胶体金标记兔抗猪瘟病毒纯化后的多抗，组装免疫层析试纸条，用试纸条和荧光抗体试验同时对 8 份猪瘟可疑病料进行检测，结合阳性符合率为 83%。
    夏照和 （2008 ） 采用环磷酰胺免疫抑制法， 用纯化的杆状病毒表达的猪瘟疫苗株 （HCLV 株 ） E2 蛋白作为耐受原，石门株 E2 蛋白作为免疫原免疫小鼠， 获得抗 E2 蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于鉴别猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株，为研究猪瘟强毒和弱毒之间的分子差异奠定了基础。杨明等（2010 ） 用胶体金标记猪瘟特异性单克隆抗体， 将纯化的 CSF 抗体和羊抗鼠 IgG 分别包被在硝酸纤维膜上作为检测线和质控线，然后用所研制出的试纸条检测了 70 份待检样品， 结果与病毒分离鉴定的符合率高达 92.8%。 用试纸条对猪传染性胃肠炎病毒、 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等进行检测， 无交叉反应，敏感性较高。王向鹏等利用猪瘟病毒 E2 蛋白的单克隆抗体为捕捉抗体， 建立了快速、 简便的检测猪瘟病毒野毒的胶体金免疫层析方法。该试纸条不与猪瘟兔化弱毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、 猪圆环病毒 2 型等反应， 其检出病毒培养物的最低检测限为 103.5TCID50，具有良好的特异性、 敏感性和重复性。 初步达到了区分检测 CSFV 野毒株和弱毒株的目的， 目前已申请了专利， 为猪瘟强、弱毒的鉴别诊断提供了高特异的快速诊断方法，应用前景广阔。

2利用胶体金技术检测猪瘟抗体
    孔繁德等 （2003 ） 以猪瘟抗原包被硝酸纤维素膜，用胶体金标记金黄色葡萄球菌 A 蛋白 （SPA ） 直接显色 （阳性者出现红色斑点） ， 建立了检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒。该试纸盒操作简单， 整个试验过程仅需 5min， 与猪蓝耳病、 猪伪狂犬病、 猪细小病毒病等阳性血清不发生交叉反应。应用该试纸盒与 Dot-ELISA 法、间接血凝试验同时对200 份猪血清进行猪瘟抗体检测比较，结果符合率达98.4%和 98.9%， 非常适用于猪瘟的早期诊断和普查，以及疫苗接种后抗体水平的检测。王荣等 （2009 ） 在此基础上， 将提纯的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗原同时包被在硝酸纤维膜上， 利用胶体金标记 SPA 显色，建立了能同时检测 CSF 和 PRRS 的双重斑点免疫金渗滤法，该方法可以同时检测 CSF 和PRRS 两种抗体， 且特异性高、 重复性好， 对这两种疾病的预防和临床检测具有十分重要的意义。刘畅、 郑鸣、 王慧杰、 李华玮等以猪瘟兔化弱毒E2 基因表达后的纯化蛋白为弱毒抗原， 以 PK-15 细胞培养纯化后的猪瘟病毒强毒为强毒抗原进行胶体金标记， 运用双抗原夹心法建立了猪瘟抗体检测的免疫层析试纸条。该试纸条与猪瘟兔化弱毒、 牛病毒性腹泻病毒、 传染性胃肠炎病毒、 猪流行性腹泻病毒、 猪伪狂犬病毒、 猪细小病毒、 猪传染性胸膜肺炎、 猪衣原体、 猪萎缩性鼻炎等无明显的交叉反应， 显示了较好的特异性。此外， 该试纸条可很好地避免因试验操作误差造成的假阳性、 假阴性， 还具有操作简单、 灵敏度高、 不需特殊设备、 价格低廉、 能区分强弱毒感染等优点， 非常适合基层实验室对猪瘟的临床诊断和现场检测。同时， 该试纸条的建立在典型猪瘟标记疫苗的研制与应用中具有重要的血清学鉴别功能， 对于监测猪瘟病毒流行情况、 疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要的作用。
    李学伍等 （2012 ） 利用基因工程方法将猪瘟病毒C 株 Erns 和 E2 基因主要抗原域连接后在原核表达系统中表达， 获得嵌合蛋白 CnC2， 将纯化后的嵌合蛋白进行胶体金标记，并在硝酸纤维膜上包被抗 CnC2单克隆抗体，建立了猪瘟抗体检测的免疫层析试纸条。该试纸条可在 5min 内出检测结果， 无需特殊仪器和技术，敏感性和特异性分别高达 97%和 100%，非常适合猪瘟抗体滴度的临床检测和调查。

3讨论
    胶体金免疫技术具有快速、 灵敏、 操作简便等优点， 可最大限度地避免试验过程中各种因素的干扰，并减轻实验室人员的工作强度， 为猪瘟的快速诊断提供了新模式， 特别适用于基层防疫员和规模户， 是未来猪瘟临床诊断的主要发展方向。但随着该技术的临床应用， 胶体金试纸的一些问题也逐渐暴露出来。综合以上文献可以看出， 胶体金试纸条的猪瘟阳性检出率从 36.4%到 92.8%不等，与操作相对复杂、耗时相对较多的 ELISA、 荧光抗体试验相比， 还是有漏检和误检。因此， 试纸的敏感性、 特异性还需进一步提高和加强。笔者建议从以下几方面进行改进： 一是完善胶体金的制备工艺， 最好能够实现标准化和程化， 从而提高胶体金的质量， 提高检测的准确性和可重复性， 减少假阳性、 假阴性； 二是确定金溶胶与被标蛋白质的最佳用量比例， 每次标记时都要测定二者具体的稳定点， 以获得最佳标记率； 三是改变蛋白吸附时的 pH 值， 以此调节膜的蛋白吸附量， 从而提高检测的灵敏度； 四是要尽量提高金标蛋白的纯度， 最好是使用纯化后的单克隆抗体等来提高试纸条的敏感性。
    此外， 笔者从王荣等 （2009 ） 的试验中可以预见，胶体金试纸条还可以有更多的发展。即可以在同一膜上同时包被多种抗原或抗体，当进行一次检测时即可得到多个项目的测定结果，实现猪瘟与其他猪病的鉴别诊断。

上一篇： 农业部督查组检查江苏省动物无害化处理工作

下一篇： 四川农村规模猪场的建设