猪支原体肺炎的病原学原理
熊炜 四川农业大学
猪支原体肺炎(MPS)又称地方流行性肺炎(EP),是一种慢性呼吸道疾病,其原发病原是猪肺炎支原体(MHYO)。其它呼吸道病原,如猪鼻支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪源支气管败血波氏杆菌、多杀巴氏杆菌等也经常继发感染。EP是一种广泛发现于世界各国畜牧业的猪呼吸道疾病,其特点是发病率高,死亡率低。
感染MHYO的临床症状主要为慢性无痰性干咳,也可能表现为亚临床过程;若发生继发感染,临床症状包括发热和呼吸困难,病猪可能出现死亡。此外,MHYO与猪呼吸道综合征的发生密切相关,这是一种既有细菌又有病毒参与的疾病,感染14-20周龄的肥育猪,临床症状表现为发烧、呼吸困难、咳嗽和食欲减退,从而使饲料转化率降低,生长速度减慢。
通过抗菌药物和疫苗的使用,管理方法的改进已在很大程度上减轻EP对猪群健康产生的不利影响,但是,在全球的养猪业中,由该病造成的经济损失仍然非常严重,饲料转化率降低、平均日增重减少和治疗成本的增加是导致这些损失的主要原因。
1.病原的基本特性
MHYO是支原体科支原体属的成员,因其没有细胞壁,形态具有多样性,大小不等,在肺触片和液体培养物中常呈球状,直径约0.2-0.5μm,偶有长链状、丝状和新月状。它仅有3种细胞器,即细胞膜、核糖体和原核细胞核。细胞膜厚度约为8-11nm,由3层单位膜所构成。MHYO营养要求高,需要从体外摄取多种能通过细胞膜营养物质,如氨基酸、脂肪酸、胆固醇和维生素。
2.病原的分子生物学
和其它支原体一样,MHYO是最小的、最简单的半保留复制的原核微生物,其没有染色体,只具有染色质,即核质。其基因组比细菌少几百万个碱基,缺少或缺失很多基因,如有关核酸前体、维生素和脂肪酸合成的基因。chris等测定了 MHYO232的基因组,其大小为892,758bP,蛋白编码基因共有692个。该研究发现,MHYO基因组中的G+c含量较低,为28.6%,这可能使其失去一些通用密码。在一般的生物中为终止密码的TGA,在MHYo中则为色氨酸的密码子。
3.病原的免疫原性
由于MHYO缺乏细胞壁,其主要抗原存在于荚膜和细胞膜。荚膜中含有的多种勃附蛋白和豁附相关蛋白,细胞膜上的含有多种膜蛋白,这些蛋白是产生免疫反应的主要抗原。研究者已对多种抗原蛋白进行了深入研究,并且不断发现新的蛋白抗原。P97蛋白,这是一种纤毛结合蛋白。研究发现P97C末端附近有Rl和R2两个重复区。张敬启等研究发现,单克隆抗体具有抑制MHYO结合猪气管纤毛的能力。用免疫印迹试验进行进一步研究发现,与该单克隆抗体反应的是一种分子量为97ku的蛋白质。P97蛋白随机分布于MHYO的表面。在感染MHYO后,最早产生的抗体是针对P97的IgM和IgA。Hsu等对P97的粘附作用部位和抗原识别表位进行了初步定位,发现P97的Rl区域能够发挥独立的粘附功能。MinionF,c等研究发现,P97蛋白Rl区含有25个连续saa重复基元,单克隆抗体能识别其中的三个。
至此,P97粘附作用的部位与单克隆抗体的识别表位在分子水平上被阐明。此外,研究发现,与常规疫苗相比,用Rl亚基重组疫苗免疫后,小鼠和猪能产生更高水平的IgG。P46蛋白,它是种特异性的膜蛋白,Futo等将P46基因克隆到载体,转入大肠杆菌进行原核表达后,纯化重组蛋白,将该蛋白应用于检测MHYO抗体的ELIsA,可以消除与猪其它支原体之间的交叉反应。覃青松等研究表明P46蛋白也是一种抗原蛋白。通过重叠延伸PcR,迟灵芝等定点突变了P46基因的三个位点,之后克隆到表达载体pET-32(+)中,用PTG进行诱导后,在 E.coliRosetta(DE3)宿主菌表达成功。研究表明,该融合蛋白免疫原性较好。
P65蛋白和P42蛋白,P65蛋白是一种携带有种特异性抗原决定簇的膜蛋白,其特性与脂酶类似。P42蛋白,这是一种由1655个核普酸编码的热休克蛋白质。Kim等鉴定出P65蛋白,经单克隆抗体和多克隆抗体证实,P65是MHYO的一个主要抗原,其免疫原结构域置于细胞膜外侧。将基断口尸裕基因克隆到载体上,并用E.。oli进行原核表达,用表达产物免疫BALB/。小鼠,获得了单克隆抗体,该抗体具有很高的特异性。Ya-Leichen等研究发现,针对P42蛋白的单抗能够抑制MHYo的生长繁殖。
Jochen等研究发现了保守脂蛋白呱p378,将其表达为重组GST融合蛋白,作为包被抗原和猪阳性血清反应,发现Mhp378只和抗MHYO的阳性血清反应,推断该蛋白为种特异性蛋白。砒p366蛋白,Meens等鉴定出一种能和康复期猪血清强烈反应的蛋白Mhp3,该蛋白不和疫苗免疫猪的血清反应。因此,Mhp366是第一个被鉴定的可以用于诊断包括免疫猪群的MHYO感染的抗原蛋白。此外,Paul等鉴定了至少5种抗原蛋白,包括4种新蛋白:热休克蛋白70、延伸因子Tu、丙酮酸脱氢酶El一p亚基和膜蛋白P76。
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