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牛传染性鼻气管炎的诊断与预防

    牛传染性鼻气管炎(IBR)又称传染性脓疱性外阴阴道炎(IPV),是由牛疱疹病毒 1 型(BHV-1)引起的牛的一种急性接触性传染病。临床上分呼吸道、生殖道、脑、结膜等多种感染类型。呼吸道型以呼吸道黏膜发炎、水肿、出血和坏死为特征;生殖道型以生殖器官出现小脓包病变为特征,表现为脓疱性外阴阴道炎和龟头包皮炎,成年母牛还常伴有乳房炎、流产、受孕率降低和奶产量下降等症状;脑膜炎型主要发生于犊牛,表现共济失调、角弓反张等脑炎症状;结膜炎型主要表现眼结膜充血、水肿和点状坏死,眼部出现浆液性或脓性分泌物。该病死亡率较低,多呈亚临床经过,但易继发细菌感染,导致支气管肺炎等严重呼吸道疾病。

  由于大量潜伏感染牛的存在,因此通过有效的诊断措施,隔离淘汰阳性牛只,使牛群逐渐得到净化非常重要。另一方面,对于有该病流行的区域和牛群实施免疫接种,也是十分重要的控制措施。

  牛传染性鼻气管炎的诊断

  对于牛传染性鼻气管炎的诊断方法有病原学检测方法和血清学检测方法。

  病原抗原检测可采用中和试验、荧光抗体试验以及ELISA等方法,其核心试剂为 BHV-1 特异性抗血清或单抗;病原核酸的检测可采用普通 PCR 或实时 PCR 技术,其核心试剂是针对病毒核酸的特异性引物;亚型的区分可采用亚型特异性单抗,也可采用限制性内切酶 Hind III 对病毒核酸进行酶切电泳分析来进行。

  PCR 技术特别是实时 PCR(荧光定量 PCR)比病毒分离更加敏感,阳性检出率比病毒分离高出5 倍,应用也越来越广泛,特别是对精液中病毒的检测更为便捷,是OIE 指定的病原检测方法。PCR 引物的设计主要针对保守性较高的基因,如TK、gB、gC和 gD基因等。目前,该方法还不能区别强毒株和弱毒株,但针对 gE 的 PCR 可用来区别野毒株和 gE 缺失疫苗株。PCR 还可以用来区别不同型的牛疱疹病毒

  OIE指定的荧光定量 PCR 检测方法所用的引物和探针序列如下:

  引物1 gB -F:5’-TGT-GGA-CCT-AAA-CCT-CAC-GGT-3’

  位于 BHV-1 基因组的第 57 499—57 519 位核苷酸序列。

  引物 2 gB-R:5’-GTA-GTC-GAG-CAG-ACC-CGT-GTC-3’

  位于BHV-1 基因组的第 57 595—57 575 位核苷酸序列

  TaqMan探针:5’-FAM-AGG-ACC-GCG-AGT-TCT-TGC-CGC-TAMRA-3’

  位于 BHV-1 基因组的第 57 525—57 545 位核

  苷酸序列

  结果判定标准:Ct 值≤45 判为阳性

  血清抗体检测,可采用中和试验及多种 ELISA方法进行,如全病毒抗原间接 ELISA、gE 或 gB 阻断ELISA等,其中间接 ELISA 和 gB ELISA 敏感性较高,而 gE ELISA 敏感性较低,不过 gE ELISA 具备区别 gE 缺失疫苗与野毒感染抗体的优点。这些方法也可用于混合牛奶中的抗体检测,但敏感性差异较大,其中间接 ELISA,只要牛群数量不超过 50 头,其敏感性较好,但另外两种 ELISA 的敏感性相对较低。

  这些方法的核心试剂为全病毒抗原或基因表达抗原,配以相应的单因子血清或单抗。以 gB 单抗阻断 ELISA 的抗原制备和试验方法如下:

  将病毒感染 MDBK 细胞,当出现明显病变时,

  将细胞和培养上清-20℃冷冻,融化后再以 8 500 g离心4 h,收集含病毒的沉淀物,用 PBS 悬浮,冰浴超声裂解,然后 800 g 离心 10 min,收集上清并加入终浓度为0.5%的 NP40 将抗原灭活,运用有限稀释法确定抗原的包被稀释度,-20℃保存;将抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释,100 μL/孔包板,密封后37℃过夜,-20℃保存;其余方法和步骤与一般阻断ELISA方法相同,检测抗体采用酶标 gB 特异性单抗,试验中设阳性、弱阳性和阴性血清(胎牛血清,FCS)对照。如果血清或牛奶中含有 BHV-1 抗体,酶标单抗与病毒抗原的结合将被不同程度地阻断,反应孔中将不出现或仅出现微弱的显色反应,通过OD 值测定,计算抑制率 ([ODFCS-OD 被检样品)/ODFCS×100%],根据抑制率的大小判定结果,如:抑制率≥50%时,结果判为阳性。

  应特别注意ELISA 的非特异性问题:每批试剂均应进行特异性检验;采集血液时应尽量避免溶血;样品应在 4℃保存,且最好在 48 h 后再进行检测;血清样品在检测前应冻融一次,并在56℃灭能 30 min;未免疫的动物,最好不使用 gE ELISA 检测。

  牛传染性鼻气管炎疫苗预防

  国外商品化的 IBR 疫苗很多,包括常规弱毒苗和灭活苗、低温适应弱毒疫苗、基因缺失弱毒苗和灭活苗、亚单位疫苗等,其中基因缺失苗和亚单位疫苗统称为标记疫苗。常规弱毒疫苗所用的种毒是经细胞传代致弱的毒株;常规灭活疫苗的种毒既可以是弱毒疫苗株也可以是经分离鉴定的强毒株;低温适应弱毒疫苗的种毒是通过低温传代而获得的温度敏感变异株,病毒只能在温度较低的上呼吸道内复制并产生免疫力,而在温度较高的内脏器官中不能复制,因而毒力较弱;基因缺失活疫苗或灭活疫苗的种毒是用分子生物学方法将病毒复制非必需基因(如gE 或 TK)缺失而产生的弱毒株;亚单位疫苗则是用基因表达抗原(如 gD)生产的。值得注意的是,虽然所有疫苗均具有较好的临床保护效果,但还没有一种疫苗能防止强毒感染,因此实施牛群净化仍是控制该病最有效地措施。

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