３．４　提高血清存活蛋白

     Ｈｏｒｎｅ等［４７］克隆并测序了ＡＰＥＣ菌株的提高血清存活（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｅｒｕｍ　ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｉｓｓ）基因。Ｉｓｓ基因在ＡＰＥＣ菌株比在健康禽类粪便分离的共栖大肠杆菌菌株中更为常见，故认为其与ＡＰＥＣ毒力有关［４８－４９］。Ｌｙｎｎｅ等［５０－５１］试验结果表明，基于Ｉｓｓ蛋白的重组疫苗能保护２８日龄肉仔鸡免遭呼吸道大肠杆菌病侵袭。将该蛋白制成油包水乳剂疫苗皮下接种２８日龄肉仔鸡，然后用Ｏ２或Ｏ７８ＡＰＥＣ肌肉攻毒。进一步将Ｉｓｓ蛋白制成ＱｕｉｌＡ佐剂疫苗肌肉注射肉仔鸡，随后用Ｏ１、Ｏ２或Ｏ７８ＡＰＥＣ气囊攻毒。上述试验表明免疫鸡在死亡率和损伤等级方面均低于未免疫对照组。然而，最高抗原剂量（５０μｇ）免疫组的损伤等级反而高于最低抗原剂量（２μｇ），这种病理变化是剂量依赖性的，且在免疫保护与疫苗剂量间存在“明显的”反向关系，其原因可能与高剂量的Ｉｓｓ造成的免疫病理有关。

     温度敏感血凝素（Ｔｓｈ）是一种由定植于呼吸道ＡＰＥＣ分泌的一种自动转运蛋白，在ＡＰＥＣ黏附禽呼吸道方面具有重要作用。自Ｐｒｏｖｅｎｃｅ等［５２］报道ＡＰＥＣ的ｔｓｈ基因以来，经过２０年的研究发现，Ｔｓｈ为双功能蛋白，具有黏附和蛋白溶解活性［５３］，存在于多数甚至所有ＡＰＥＣ，与雏鸡的高死亡率菌株有关［５４］。鉴于Ｔｓｈ在ＡＰＥＣ致病机理方面是一个重要的毒力因子，故其可作为研发新型药物和开发广谱疫苗的关键靶或潜在途径［５５－５６］。综上所述，亚单位疫苗较灭活疫苗具有更好的保护免疫应答，特别是对异源菌株攻毒方面。事实上，此类疫苗缺乏或未公布商业背景下的跟踪研究，故关于疫苗的田间结果不可能得出任何结论。截至目前试验研究的ＡＰＥＣ亚单位疫苗见表３［２２］。

     理想的广谱疫苗靶应具备以下特征，即暴露于细菌表面、广泛分布于临床分离的肠外致病性大肠杆菌（ＥｘＰＥＣ）而非致病菌或栖生菌缺如、不同Ｅｘ－ＰＥＣ株间的表位保守、可刺激机体产生保护性免疫应答、在感染部位高效表达并涉及疾病的致病机制。为此，Ｄｕｒａｎｔ等［５７］开发了一种针对ＥｘＰＥＣ的蛋白疫苗。他们利用比较基因组学分析对非致病性大肠杆菌株Ｋ－１２ＭＧ１６５５与ＥｘＰＥＣ菌株Ｃ５（脑膜炎分离株）和ＣＦＴ０７３（尿道感染分离株）鉴定了ＥｘＰＥＣ特异的基因组区域。通过对这些区域的分析筛选出了４０个开放阅读框（ＯＲＦ），这些阅读框在Ｂ２／Ｄ临床分离株保守并编码推定的外膜位点的蛋白。克隆这些基因并纯化重组蛋白以确定其作为候选疫苗的潜力。免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，５种蛋白诱导产生了抗Ｂ２群临床大肠杆菌株致死量攻毒的强烈保护免疫力。被动免疫试验表明抗原特异性抗体赋予了新生小鼠抗致死量攻击的保护。其中３种抗原与Ｅｘ－ＰＥＣ重要的毒力因子铁获得代谢相关，两种为未知特性的新蛋白。由于大肠杆菌栖生菌和致病菌间存在大量的遗传差异，其研究结果表明对这些株建立的特异性免疫保护应答可能是识别靶。５种保护性亚单位疫苗是防控ＥｘＰＥＣ引发疾病的基础。Ｍｏ－ｒｉｅｌ等［５８］则将自新生儿脑膜炎分离的ＥｘＰＥＣＩＨＥ３０３４（ＳＴ９５）基因组序列与公布的其他ＥｘＰＥＣ株和一些非致病性大肠杆菌的序列比对后发现非致病性大肠杆菌缺乏１９个存在于ＩＨＥ３０３４基因组的基因组岛。通过差减反向疫苗学技术，他们鉴定了２３０个ＥｘＰＥＣ特有的抗原，其中９个抗原在小鼠攻毒试验中具有保护性，有些也存在于其他非ＥｘＰＥＣ致病性菌株，故认为研究广谱保护大肠杆菌疫苗是可行的。编码多数保护性抗原的基因序列高度保守并通过Ⅱ型分泌系统分泌，但其在非致病性菌株中却无功能。

     １９９９年，Ｒｏｌａｎｄ等［５９］报道了腺苷酸环化酶（ｃｙａ）和环腺苷酸（ｃＡＭＰ）受体蛋白（ｃｒｐ）基因缺失的鼠伤寒沙门氏菌突变株。将大肠杆菌ｒｆｂ区（编码Ｏ７８Ｏ抗原重复单位的基因）插入到鼠伤寒沙门氏菌染色体ｃｙａ基因，然后缺失ｃｒｐ基因以构建精细的插入／缺失突变株。禽致病性鼠伤寒沙门氏菌△ｃｙａ△ｃｒｐ衍生菌表达同源Ｂ群决定簇（Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ１２）和异源大肠杆菌Ｏ７８ＬＰＳ　Ｏ抗原。用此重组疫苗株免疫出壳当天和１４日龄的白来航雏鸡可诱导产生抗鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌ＬＰＳ的血清免疫应答，雏鸡对随后ＡＰＥＣ　Ｏ７８的攻毒获得保护。导入ｒｆｃ基因的突变株降低了鼠伤寒沙门氏菌ＬＰＳ的表达，却提高了抗大肠杆菌的特异性应答。虽然此途径证明有保护力，但缺乏进一步的研究或田间试验。

     ５．２　可饲植物疫苗

     通过植物基因工程技术利用可饲植物生产制备疫苗和治疗用蛋白具有巨大潜力。由于多数禽病原体感染是经黏膜侵入宿主，故评估非复制性家禽疫苗效力的重要标准是安全有效的黏膜佐剂活性。

     Ｍｉｌｅｒ等［６０］通过不同途径试验在转基因烟草属管状花目（ＮＴ－１）烟草细胞系（ＳＬＴ１０２）产生的生物活性大肠杆菌重组野生型热不稳定肠毒素（ＬＴ）和重组突变ＬＴ（ＬＴＡ－Ｋ６３／ＬＴＢ）的安全性和抗原性。

     安全性评估采取临床症状、增重、肉眼器官病变、器官重量及组织学病变进行。抗原性评估采用ＬＴ－Ｂ－特异性血清ＩｇＧ酶联免疫吸附试验。肠外接种大肠杆菌重组野生型ＬＴ对健康仔鸡无任何副作用并每只可耐受高达４００ｍｇ的剂量。重复黏膜给予重组子ＳＬＴ１０２体外保留神经节苷脂联接且安全并具有抗原性。接受３次含突变ＬＴ的ＳＬＴ１０２饲喂剂量的鸡获得最高的全身ＬＴ－Ｂ－特异ＩｇＧ滴度。在试验ＳＬＴ１０２不同的制剂中，全细胞、湿细胞或全细胞溶解物抗原性最强。这些结果首次表明源于重组野生型ＬＴ全毒素的大肠杆菌多次给予仔鸡对原先报道的哺乳动物体重剂量引起的肠致病性和毒性具有很好的耐受性。然而，这些数据也表明在转基因ＮＴ－１烟草细胞中产生的重组野生型和突变ＬＴ在家禽可作为安全有效的疫苗佐剂。

     有效的ＡＰＥＣ疫苗是防控目前现代规模化养禽业ＡＰＥＣ感染的关键。由于大肠杆菌血清型众多且不同血清型甚至不同菌株之间缺乏交叉免疫，故开发具有交叉保护的广谱疫苗将是防控该病的趋势。ＡＰＥＣ疫苗必须对异源菌株攻毒提供有效的保护，而几乎所有关于灭活疫苗的研究表明仅对同源菌株保护。尽管ＡＰＥＣ疫苗研究进行了数十年，且采用了不同的免疫程序和攻毒模型，但达成的共识是某些弱毒疫苗和亚单位疫苗可提供异源保护。由于弱毒疫苗是足够致弱的菌株，不引起临床疾病，但必须能抵抗宿主的防御以在体内生存足够长的时间来保护异源菌株攻击［１７，２４，５９］。就亚单位疫苗来说，通常选择不同血清型保守的抗原［４６，５０，６１］，故对异源保护也是意料之中的。然而，亚单位疫苗在体内不能复制，需加强佐剂重复注射。因此，亚单位疫苗在肉鸡市场商业应用方面与弱毒疫苗相比缺乏竞争力和吸引力。虽然通过基因工程技术生产制备亚单位疫苗具有相对简单的优势，但生产灭活疫苗和弱毒疫苗的劳动力更廉价和便宜。也许，通过载体递送或嵌合疫苗的形式选择抗原接种将会克服这些弊端［６２］。

     通过生物信息学、基因组学和蛋白组学的综合运用必将鉴定出更多的新型候选菌苗株。特别是近年来兴起的特征标记转座子诱变技术（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ－ｔａｇｇｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、体内诱导抗原技术（ｉｎ　ｖｉｖｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、反向疫苗学技术（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ）和免疫蛋白组学（ｉｍ－ｍｕｎｏ－ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）途径等使鉴定新的疫苗候选株成为可能。然而，值得注意的是Ｏ１、Ｏ２和Ｏ７８等优势ＡＰＥＣ血清型在不同感染阶段的感染机制不同，这也是设计或研发交叉保护疫苗必须克服的一大弊端［６３］。此外，在后基因组时代所面临的挑战乃是确定编码ＡＰＥＣ基因在致病机理和传播中的作用及细胞组分在建立保护免疫中的功能。因此，对像ＡＰＥＣ血清型众多的病原体而言，阐明编码基因的所有组成成分、序列及表达对变异的影响将是未来开发广谱交叉保护疫苗的方向［６４］。相信随着ＡＰＥＣ基因组序列公共数据库的完善、共享及其新毒力因子的不断发现、致病机理的逐渐阐明势必为开发更有前途的新型广谱疫苗奠定基础。

致谢：美国Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ访问学者宋勤叶博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌａｂａｍａ闫志民教授为本文的撰写及时查找了相关文献，谨致谢意。