重庆市某猪场保育猪发生严重的呼吸系统疾病，以咳嗽、稽留热、食欲减退为主，逐渐消瘦、腹泻。经抗生素治疗后症状减轻，2～3d后又复发，严重病例4～6d死亡，发病率35%，死亡率30%，场主疑为病毒感染，遂于2013年9月就诊。通过对猪场实施隔离、消毒、严格控制人员出入、治疗、实验室诊断等措施，有效地控制住了疾病的蔓延。通过病理剖检、细菌分离检测、PCＲ检测，证实该病例为猪瘟病毒及多杀性巴氏杆菌混合感染引起。

     患猪呼吸困难，呈腹式呼吸，咳嗽，部分猪伴有腹泻。病猪食欲减少或废绝，体温高热(41～42℃)，心跳加快，可视黏膜发绀，腹侧、耳根和四肢内侧皮肤出现紫斑，指压不褪色，眼睛出现分泌物。有的猪表现胸膜肺炎症状(干咳、呼吸困难)，鼻孔流出浆性或脓性分泌物，初便秘，后腹泻，消瘦无力，卧地不起。

     无菌采取病猪肺脏与肺门淋巴结加入无菌PBS液(pH值7．2)和适量灭菌石英砂研磨制成1∶5悬液，反复冻融3次后12000r/min离心30min，取上清液。并将初步纯化的病毒经30%和60%两层蔗糖(wt/wt)不连续梯度离心，收集30%～60%蔗糖间的乳白色病毒带于PBS中透析过夜，然后用聚乙二醇PEG－6000浓缩100倍，制成病毒浓缩液10mL，－80℃保存。分别取0．5mL用于DNA、ＲNA提取。试剂盒分别用10μL20mg/mL的蛋白酶K58℃孵育20min、65℃消化50min。再用QIAGENDNA提取试剂盒、QIAGENＲNA提取试剂盒进行基因组提取，提取的DNA、ＲNA基因组－20℃保存。对提取ＲNA用TaKaＲacDNA反转录试剂盒进行cDNA反转录，反转录产物于4℃保存，后进行ＲT－PCＲ检测。

     发生呼吸系统症状猪全身黏膜、浆膜和皮下组织大量出血点，咽喉部及其周围结缔组织的出血性浆液浸润。切开颈部皮肤时，可见大量胶冻样淡黄或灰青色纤维素性浆液。全身淋巴结出血，切面红色等全身出血性病变;支气管内部有少量泡沫，腹股沟淋巴结水肿、出血;有的保育猪具有纤维素性肺炎，肺脏有肝变区，周围伴有气肿;胸膜有纤维素性附着物。腹泻猪严重脱水，肠道内有多量黄色液体内容物和气体，肠黏膜充血、出血、肿胀，呈急性卡他性炎症，以十二指肠最为明显。其次为空肠和回肠，胃黏膜红肿，表面附有多量黏液，内有腥臭味和黄色凝乳块，肠系膜淋巴结呈现出弥漫性小出血点，肝脏、肾脏有小凝固性坏死灶或小出血点。

     无菌采取病猪的肺脏、肝脏组织进行触片，取病料划线接种于鲜血琼脂平板上，37℃培养24h，观察细菌的生长情况、菌落特征。挑取不同菌落形态细菌做革兰染色、镜检，挑取菌落大小均为1mm左右、表面光滑、湿润、呈露珠状菌落，划线分离培养，然后对分离培养的菌落进行瑞氏染色。纯化的细菌提取基因组，试剂盒选用QIAGENDNA提取试剂盒。

     根据临床症状分别进行伪狂犬病毒(PＲV)、圆环病毒2型(PCV－2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PＲＲSV)、多杀性巴士杆菌(PM)的PCＲ检测。

     根据GenBank设计待测病原基因上下游引物，CSFV参考基因组NC_002657．1保守区、PＲＲSV参考基因组JX512910．1保守区、JEV参考保守序列IND－WB－JE5多聚蛋白基因KC879326．1、PＲV参考gll基因M17321．1设计、PCV－2参考OＲF2基因KC336417．1、巴氏杆菌(PM)通过保守序列KMT－1基因DQ871029．1设计引物，并通过Blast比对引物特异性。引物序列见表1。

  

     CSFV、PＲＲSV及JEV为ＲNA病毒，进行ＲT－PCＲ扩增，用TaKaＲacDNA反转录试剂盒进行反转录的cDNA为模板。反应体系为25μL体系:2×TaqPCＲMasterMix12．5μL，ddH2O8．5μL，上、下游引物各1μL，反转录的cDNA2μL。

     扩增条件:95℃预变性5min;94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环;72℃延伸10min，4℃保存。

     对PＲV、PCV－2、PM进行PCＲ扩增，扩增为25μL体系:2×TaqPCＲMasterMix12．5μL，ddH2O9．5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL。

     扩增条件:95℃预变性5min;94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环;72℃延伸10min，4℃保存。

     琼脂糖凝胶电泳及成像:取5μLPCＲ扩增产物与5μL的6×LoadingBuffer，DL2000DNAMarker经1．2%的琼脂糖凝胶电泳检测，用BIO－ＲAD成像系统拍照观察。

     以病危猪肺脏做组织触片，进行革兰染色，阴性，单个存在，形态一致，菌体近圆形，两极着色不明显。后进行瑞氏染色，可见典型两极着色中间透明的短杆状菌。

     提取组织中总ＲNA的PＲＲSV、JEV病原检测结果均为阴性;组织总DNA检测的PＲV、PCV－2均为阴性;CSFV的PCＲ扩增阳性、多杀性巴氏杆菌KMT－1为阳性。

   

     对体况健康受威胁猪紧急免疫接种猪瘟－蓝耳病二联弱毒疫苗。将病猪赶至同一圈舍，两圈舍相隔20m。严格限制人员进出，控制人员流动，封锁疫病猪舍通道，将猪场人员分为两部分，一部分服务于患病猪舍，另一部分服务于健康猪圈舍，并严格控制两部分人员交叉接触。饲料、器具严格分开使用，并严格限制放置地点。人员进入圈舍后严格更换衣服，灭菌消毒。对死亡猪进行深埋处理。

     用1∶100菌毒杀消毒猪舍及周围环境、进出通道，每天2次。圈栏、器具每2d用神五消毒液500倍液与金碘消毒剂600倍液稀释交替消毒。人员进出更换衣服，并用1∶200菌毒杀喷洒衣物、鞋子。

     病猪采用猪瘟－蓝耳二联高免血清按每千克体重0．05mL注射，每只每天2次，连用3d;地塞米松注射液1mL，每只每天1次，连用3d;抗生素用诺氟沙星与卡那霉素联合用药，肌肉注射，每千克体重诺氟沙星0．3mL、卡那霉素0．1mL，每天2次，连用10d;对血便、腹泻猪肌肉注射止血敏，每只每天注射1mL，连用2d，并对其进行口服灌液，液体参入氯化钾、维生素C、维生素B1、维生素B2;对食欲较差或拒食病猪，灌液中加入葡萄糖。

     目前，猪瘟的很多临床症状表现为非典型，仅凭临床症状已无法确诊，并极易造成误诊，混合感染在猪病中所占比例越来越大，更给兽医临床诊断带来了很大的困难。所以必须经过实验室检验等综合性诊断才能确诊，面对混合感染愈加严重的情况一定要分清主次，以便采取综合性防治措施，才能迅速控制疫情。

     对于猪病的防治，一定要以预防为主，定期免疫接种重大疫病疫苗。对继发性感染的病猪，一定要快速鉴别致病菌，并对其进行药敏试验，以便快速针对继发感染细菌选择敏感性抗生素，以防止滥用抗生素导致的抗生素失效。

     要保持饲养场与外界隔离，以防止外来病原对本场牲畜侵袭。严格控制人员、车辆进出，进出要有消毒措施。对购进牲畜要进行隔离，以防止潜在病原带入养殖场，影响本场健康牲畜。饲养用的器具、水要严格消毒。人员应在工作中多注意牲畜情况，以做到早发现、早隔离、早治疗。

(重庆市畜牧技术推广总站，朱燕;西南大学，胡艳;重庆市南岸区农林水利局，黄晓玲)