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顾江萍 上海交通大学1.杆状病毒载体 杆状病毒基因组较大，易插入外源DNA片段，对脊椎动物细胞无致病性，重组杆状病毒载体安全性高，兽医领域应用十分广泛。 Shoup等将TGEV的S基因插入杆状病毒转染到质粒PVL941的启动子下游附近，与经酶切线性化的杆状病毒DNA共同转染sf9细胞，经空斑筛选获得高效表达的重组杆状病毒，该表达产物与弗氏完全佐剂配制的抗原免疫Lewis大鼠，能够产生高效价的中和抗体。 Tuboly等将TGEVS基因的7个片段和全长S基因的cDNA片段克隆在杆状病毒载体中表达。重组病毒免疫乳猪后，发现S基因中5’端包含4个主要抗原位点片段的重组病毒诱导的病毒中和抗体与全长S蛋白诱导的抗体相当。还发现只有结构中包含抗原位点A的S糖蛋白才能产生高滴度的中和抗体，缺乏位点A、D的重组体不能诱导与全长S蛋白诱导的中和抗体一样的抗体水平。 GodetM.等用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达S基因，表达产物与弗氏完全佐剂配制成疫苗，免疫35d龄路易斯鼠，能够产生高效价的中和抗体；12d后，鼠血清中和试验的效价达1:2500；用表达的S糖蛋白作为弱毒苗免疫妊娠母猪后的加强免疫，可显著提高母猪血清和初乳的抗体水平，其对仔猪的保护率比弱毒苗两次免疫还高14%，但S蛋白亚单位苗单独免疫效果不佳。2.减毒沙门氏菌载体 近年来，以减毒细菌为载体携带DNA疫苗进行口服免疫被证实是激发粘膜免疫的一种理想途径。减毒沙门氏菌是通过物理、化学或基因工程等方法，使沙门氏菌某些特定的基因发生不可逆的突变。使其毒力大大降低，感染宿主细胞后可在体内生长繁殖。沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，可用其作为疫苗载体携带原核表达质粒和真核表达质粒，重组减毒沙门氏菌疫苗制备简单，免疫方便，有较强的免疫原性，能诱导持久的免疫反应，尤其可诱导较强的黏膜免疫反应。减毒沙门氏菌载体由于其特殊的优点而被广泛应用于疫苗研究。 SmerdouC等用减毒沙门氏菌为载体表达TGEV的S基因，由于表达的蛋白缺少糖基化依赖的构象免疫决定簇A，接种鼠、兔、猪后，均产生低水平的或者没有产生中和抗体，将表达的蛋白包被糖基化依赖的抗原决定簇(位点A，B)，接种动物则能够产生各种水平的中和抗体和保护力。 杨恒等也通过减毒沙门氏菌为载体，成功构建了携带TGEVDNA疫苗的活载体口服疫苗，并显示出良好的免疫原性和安全性。HuaiqingChen等将TGEVS基因的A位点和C位点插入到鼠伤寒沙门氏菌苗的菌毛中，经口免疫BALB/c小鼠，发现诱导的抗体能识别TGEVS蛋白的抗原位点。3.痘病毒和腺病毒载体 痘病毒具有基因组容量大及非必需区基因多的特点，有利于进行基因工程操作，易于构建和分离重组病毒。它还可以插入多个外源基因，并对插入的外源基因有较高的表达水平。腺病毒容易增殖、使用方便、稳定性良好，具有广泛的免疫适应性，既可以在呼吸道增殖，也可以在消化道增殖，因此具备作为活病毒口服疫苗载体的条件。两种重组病毒不需佐剂即可免疫动物，成为基因重组疫苗研究的有效工具。 BrittonP和TorresJM等将S基因插入到痘病毒和腺病毒载体中，然后用这两种重组的痘病毒和腺病毒免疫动物，均可诱发抗TGEVS蛋白的中和抗体。 唐芳等将S蛋白基因5'端包含B、C抗原位点的1.0kbDNA片段，并与穿梭载体pShuttle-CMV连接；然后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化，获得了1株含有TGEVS蛋白5’端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒。细胞连续传代9次后，病毒效价稳定。动物免疫试验显示，重组病毒可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。
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