消化道微生物的研究手段
谢飞 南京农业大学
1.消化道微生物的传统分离培养
传统的消化道微生物研究以微生物的分离培养为基础，利用各种培养基分离培养肠道微生物菌株，然后对各种菌株进行单一或者组合共培养，研究细菌个体或菌群间的相互作用及功能。虽然在过去近半个世纪里传统技术取得了许多重大进展，如厌氧培养技术的发明使用，动物模型的建立以及无菌动物的应用等，然而畜牧研究显示胃肠道中可培养的细菌占肠道总细菌的比例仍然只是少数，绝大多数肠道微生物难以在肠道外部培养，而且相关研究易丢失微生物多样性、不能准确的反映肠道微生态的多样性，且大量具有科研和应用价值的新基因由于存在于难以培养或不可培养的微生物中，而无法被研究和利用:其次，通过体外培养研究以及相互组合共培养研究，并不能真实反映其在肠道内部的生理生化反应，与实际复杂的肠道环境有较大差异，结果也存在一定的误差。这些方法均不能全面真实地反映肠道微生物区系的功能，这都在一定程度上影响了对肠道微生物系统深入的研究。因此，寻求新技术在肠道微生物研究领域的应用成为一种必然，随着认识以及技术的进步，许多辅助研究手段逐渐出现并被应用，如体外厌氧发酵技术，该技术以肠道食糜或粪样为接种物，体外模拟研究肠道微生物的代谢特性，能够相对较好地模拟动物体内的实际情况。同时，体外厌氧发酵技术也可用于目标菌株的分离筛选，接种培养后某些特定的菌群得到富集，目标菌株也更容易获得。
2.消化道微生物的分子生物学研究
鉴于传统方法的局限性，科研人员逐渐开始应用以细菌核糖体RNA序列(165rRNA)分析为基础的分子技术来研究各种生态系统中的菌群，这其中也包括哺乳动物的胃肠道微生态系统。微生物在相当长的生物进化过程中，rRNA分子功能几乎保持恒定，而且有些部位分子排列顺序变化非常小，从这种排列顺序可以检测出种系发生关系。rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。保守性能够反映出生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索;高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。细菌rRNA有3种类型 :235rRNA、 165rRNA和 55rRNA。其中 165rRNA的相对分子质量适中，较易于进行序列测定的分析比较。目前165 rRNA/rDNA作为一个科学可靠的指标广泛用于微生物遗传特征和分子差异研究，极大拓展了肠道微生物研究的内容。通过对细菌分类以及对进化标记基因 165rRNA的测序，能够全面深入地反映微生物群落结构的多样性，使人们对肠道微生物有了更多新的认识。
3.消化道微生物的功能研究手段
肠道微生物的研究主要在于了解其功能，因此近年来的相关研究逐渐由过去研究肠道微生物的组成向肠道微生物的功能转变，这也促进了许多新技术及方法的应用，如宏蛋白质组学技术。利用该技术可以研究生态环境中各种微生物群落的功能，主要原理是:提取样品总蛋白后，利用2一D(二维)电泳对总蛋白进行分离，后分析电泳图谱，并对图谱中的蛋白点进行鉴定并与数据库进行比对，确定蛋白质信息，了解其功能。该技术的优点在于可以对不同样品的图谱进行对比，找出差异较大的蛋白点，进行序列分析，由此揭示微生物的功能。
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