猪输血传播病毒流行病的病原学诊断方法
刘建波 中国农业科学院
猪输血传播病毒流行病的病毒核酸（PCR），其基本原理是以目的扩增DNA分子为模板，加热变性后分成两条互补连，加入一对人工合成的与模板特异性互补的寡核苷酸片段，即引物，在低温退火条件下，引物与模板互补区域特异性结合，DNA聚合酶在合适的延伸温度下，沿模板链按照半保留复制机制延伸，合成新的DNA。当这些步骤经多次不断重复，可使目的DNA片段得到大量扩增。DNA的扩增程几何指数增加，20~40个循环后便可获得大量目的基因片段。PCR应用领域广泛，包括病原体的检测，是一种简便、特异、快速、高效的诊断方法,可以从各种细胞培养物、组织以及中血液扩增出目的基因片段，经电泳后得出诊断结果，该方法在传统PCR技术基础上得到了充分的发展，目前已根据其原理建立了如PCR、多重PCR、环介导恒温扩增PCR、巢式PCR、定量PCR和竞争PCR等。
1 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）
自1997年Nishizawa首次获得TTV病毒的基因组以来，建立了TTVs的PCR检测方法。由于其设计的引物N22位于ORF1的高变异区域，以其作为引物进行检测。由于引物的特性，只能检测出其同种型的TTV基因群，却不能检测出TTV的不同基因群，因而不能充分反映TTV的实际感染情况。针对上述缺陷，Takahashis等根据基因组中的保守的UTR区域设计引物，建立了PCR检测方法，能检测出已知不同基因型的变异株，TTV的阳性检出率明显高于用N22 PCR的检测结果。2002年，Okamoto根据人TTV基因组的非编码区设计引物，成功地在猪、狗、猫体内扩增到TTV基因组，推断TTV有种属特异性。之后，国内外学者根据GenBank上登录的PTTV基因组序列设计一系列引物，建立了诸多PCR检测方法，用于PTTV的流行病学调查。Segalés根据PTTV基因组中的保守区域设计引物建立检测PTTV1和PTTV2的诊断方法，对1985年至2005年间的病料样品进行检测，阳性结果为PTTV1阳性率为33.3% (54/162)，PTTV2阳性率为55.6%（90/162），PTTV1和PTTV2共感染率为23.5%（38/162）。检测结果可知，目前已知PTTV的最早感染可追溯到1985年。
2 套式PCR
套式PCR也称巢式PCR（Nested PCR）。套式PCR技术普通PCR技术的原理相同，但有别于普通PCR。PCR的出现为研究样品中极微量基因提供了一个特异而强大的工具，在某些情况下仍然有不足之处。很多目的基因，由于其模板量较少，用一对引物进行PCR扩增后，产物仍不能通过凝胶电泳进行观察。针对这种情况，套式PCR技术应运而生，它共需要经2轮PCR扩增和每轮分别利用一对引物对来完成，首先用第一对引物对靶DNA进行扩增，然后以第一次PCR产物为模板进行第2次扩增，第2次PCR引物与第1次反应产物的内部序列互补，第2次扩增产物即为目的产物，其扩增片段短于第1次的扩增产物。巢式PCR的好处在于，如果第1次扩增产生了错误片断，则第2次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。该方法可以提高敏感性和特异性。王礞礞 等利用套式PCR法检测了江西、广东、福建等7个省份的280份组织样品和血液样品，结果发现我国猪群中存在PTTV1和PTTV2感染，阳性率分别高达37.6%和82.6%，PTTV1和PTTV2的混合感染率为34.5%。
3 荧光定量PCR
鉴于PCR和巢式PCR只能从定性方面来检测PTTVs，而不能从量的方面来确定病毒的载量，许多学者建立了荧光定量PCR（real time PCR，rt-PCR）检测PTTV方法。荧光定量PCR根据所用材料不同分为探针法和染料法。Andreas根据PTTVs基因组在非编码区设计了能够分别扩增PTTV1和PTTV2引物，并设计rt-PCR的探针：3’末端均有MGB淬灭集团，PTTV1探针的5’端用FAM标记，而PTTV2的5’端用VIC标记，并用建立的rt -PCR对203份猪血清样品进行了PTTVs检测，结果显示，PTTV1、PTTV2单独感染和PTTV1、PTTV2混合感染阳性率分别为32%、17%、32%，该检测结果与普通PCR方法相符。陈欣等根据PTTV基因组保守区域分别设计两对特异性引物，建立了SYBR-Green I二重荧光定量PCR，结果显示该方法具有很好的特异性、重复性，最低检出量为10 copies/ml。
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